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Studio della vitalità e della sopravvivenza cellulare in cellule beta pancreatiche immunoisolate in membrane di alginato

Informazioni tesi

  Autore: Maria Liliana Piredda
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2007-08
  Università: Università degli Studi di Pavia
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Scienze biologiche
  Relatore: Rosanna Nano
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 46

Il diabete mellito insulino-dipendente (IDDM o diabete di tipo I) è una delle patologie endocrine più diffuse.
Dal momento che, sebbene associata a notevoli complicanze, la somministrazione di insulina esogena rappresenta, ad oggi, la terapia di base più frequentemente utilizzata nel trattamento di tale patologia, i ricercatori stanno cercando di mettere a punto quella che viene definita “terapia ideale” e che, in quanto tale, deve rispondere ad alcuni fondamentali requisiti: deve produrre insulino-indipendenza, deve essere applicabile precocemente nel corso della malattia al fine di prevenire la comparsa delle complicanze tardive ed irreversibili e deve essere, infine, applicabile su vasta scala.
Proprio in considerazione di questi capisaldi, negli ultimi anni si è guardato con particolare interesse al trapianto di insule pancreatiche immuoisolate quale promettente approccio terapeutico in grado di ripristinare, nel soggetto diabetico, una corretta omeostasi del glucosio.
Tuttavia, nonostante tale studio rappresenti una prospettiva di notevoli potenzialità, ci sono ancora molti aspetti che devono essere compresi e molti problemi che devono essere risolti prima che tale approccio possa diventare un trattamento effettivamente applicabile in campo clinico.
Due sembrano essere le maggiori limitazioni all’applicazione di tale tecnica: la biocompatibilità dei materiali utilizzati nella realizzazione delle microcapsule e la sopravvivenza temporanea, e mai permanente, delle cellule trapiantate.
E’ dunque in questo contesto che si inserisce il mio lavoro di tesi, parte di un progetto di ricerca più ampio, che ha avuto come obbiettivo quello di andare a valutare l’influenza dell’immunoisolamento sul comportamento delle cellule beta pancreatiche, focalizzando l’attenzione su due parametri fondamentali, la vitalità e la sopravvivenza cellulare.
A tale scopo si è scelto di utilizzare, come modello sperimentale in vitro di cellule secernenti insulina, una linea cellulare commerciale derivata da insulinoma murino (NIT-1) e, come immunoisolanti, membrane di alginato, polisaccaride naturale carico negativamente comunemente utilizzato nel campo dei biomateriali.
Ai fini della ricerca è stata dapprima caratterizzata morfologicamente la linea cellulare mediante coloranti idrosolubili per microscopia ottica (May-Grunwald-Giemsa ed Ematossilina-Eosina) e marcatori fluorescenti (Fluoresceina Isocianato e Ioduro di Propidio) per citochimica in fluorescenza e, in seguito all’incapsulamento delle NIT-1 in alginato, sono state studiate la vitalità e la sopravvivenza mediante l’impiego di tre differenti metodiche: colorazione con Trypan Blue, MTS test e colorazione con Annessina V-FITC e successiva analisi al citofluorimetro.
Tutti gli aspetti analizzati (vitalità cellulare, sopravvivenza cellulare, fenomeni apoptotici) hanno permesso di osservare differenze oggettive nel comportamento di cellule incapsulate rispetto a cellule nude, ad indicare come la tecnica dell’incapsulamento in alginato vada ad influire in maniera significativa sui parametri cellulari considerati. E’ stato anche possibile osservare, però, come queste differenze non si traducano in una completa perdita della vitalità cellulare: le cellule che sopravvivono al trattamento mantengono, infatti, una certa capacità proliferativa, a supporto di recenti studi che hanno dimostrato come le isole possano adeguatamente sopravvivere anche in regime di immunoisolamento.
Il mio lavoro di tesi, inserito all’interno di uno studio più ampio, ha potuto quindi fornire importanti indicazioni per la messa a punto di un eventuale protocollo clinico che prevede l’utilizzo di isole di Langerhans immunoisolate nel trattamento della patologia diabetica.

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1 CELLULE BETA PANCREATICHE ED INSULINA Il Pancreas rappresenta, dopo il fegato, la ghiandola più voluminosa annessa al canale digerente ed è costituito da due porzioni, una esocrina e l’altra endocrina. Mentre il pancreas esocrino è una ghiandola tubuloacinosa composta costituita da cellule piramidali ricche di granuli secretori e zimogeno e deputate alla secrezione ed al rilascio di enzimi digestivi a livello intestinale (Gartner & Hiatt, 2004), la porzione endocrina è invece costituita da agglomerati cellulari sferici distribuiti tra gli acini, le isole di Langerhans. Queste cellule, organizzate in cordoni (Fig.1) e concentrate soprattutto nella regione terminale dell’organo, costituiscono solamente il 3% dell’intera ghiandola e sono coinvolte nella secrezione di ormoni e nella loro successiva immissione nel circolo sanguigno. Fig. 1 Organizzazione in cordoni delle isole di Langerhans (Modificato da www.edises.it). All’interno di ogni isola di Langherans si distinguono cinque diversi tipi cellulari, ognuno dei quali deputato alla sintesi di ormoni fondamentali nella regolazione del metabolismo di molti i tessuti (Fig.2). In particolare:  Cellule PP: costituiscono l’1% delle cellule totali e sono deputate alla produzione del polipeptide pancreatico, che agisce inibendo la secrezione esocrina dell’organo.  Cellule G: rappresentano l’1% delle cellule totali e sono implicate nella sintesi di gastrina, ormone che stimola le cellule parietali dello stomaco alla produzione di HCl.  Cellule delta: costituiscono il 5% dell’intera componente endocrina e producono somatostatina, responsabile dell’ inibizione del rilascio ormonale e della riduzione delle contrazioni della muscolatura liscia del tratto alimentare e della cistifellea.

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