La trascrizione negli eucarioti

La trascrizione negli eucarioti

Gli eucarioti, al contrario dei batteri in cui troviamo una sola polimerasi, durante la trascrizione utilizzano tre diverse polimerasi, che trascrivono ciascuna una classe diversa di geni:
• La RNA polimerasi I trascrive l'rRNA. Essa è localizzata nel nucleolo ed è responsabile della sintesi del 50-70% dell’RNA totale;
• La RNA polimerasi II trascrive l'mRNA. Essa è localizzata nel nucleoplasma e sintetizza il 20-40% dell’RNA totale;
• La RNA polimerasi III trascrive il tRNA e altri piccoli RNA. Essa è localizzata nel nucleoplasma e sintetizza il 10% circa dell’RNA totale.
Inoltre, mentre i batteri hanno bisogno di un solo fattore addizionale d'inizio (σ), nelle cellule eucariotiche sono richiesti numerosi fattori d'inizio addizionali. Questi fattori sono chiamati fattori generali di trascrizione (GTF). In vitro per una trascrizione efficiente basano questi fattori generali assieme alla Pol II, mentre, in vivo, essendo il DNA organizzato in nucleosomi, sono richiesti altri fattori, incluso il complesso così detto mediatore, proteine regolatrici che legano il DNA e spesso, anche degli enzimi che modificano la cromatina. In dettaglio, un promotore base eucariotico è lungo in genere circa 40 coppie di basi e si estende a monte o a valle del sito d'inizio della trascrizione. Il promotore, di norma, è costituito da quattro elementi: l'elemento riconosciuto da TFIIB (BRE), l'elemento TATA (TATA box), l'iniziatore (Inr) e l'elemento a valle (DPE, downstream promoter element). Di fatto, un promotore contiene solo due o tre di questi quattro elementi. Oltre (e principalmente a monte) al promotore prossimale, ci sono altre sequenze importanti per una trascrizione efficiente in vivo. Questi elementi costituiscono le sequenze regolatrici e sono raggruppate in diverse categorie. Queste sequenze includono: elementi del promotore prossimale, sequenze attivatrici a monte (UAS, upstream activating sequences), enhancer e una serie di elementi repressori chiamati silenziatori (silencer), elementi di confine ed isolatori. Tutte queste sequenze di DNA legano delle proteine regolatrici (attivatori e repressori) che aiutano o inibiscono la trascrizione del promotore base.
I fattori generali di trascrizione hanno, tutti insieme, la stessa funzione di σ, quindi aiutano la polimerasi a legarsi al promotore e a separare il DNA, nonché a lasciare il promotore e a passare alla fase di allungamento. Il gruppo completo dei fattori di trascrizione e della polimerasi, legati assieme al promotore e pronti per l'inizio, viene chiamato complesso pre-inizio. La formazione di questo complesso inizia dall'elemento TATA box (circa 30 bp a monte del sito di inizio della trascrizione), riconosciuto dal fattore generale di trascrizione chiamato TFIID (la nomenclatura “TFII” caratterizza il fattore di trascrizione per la Pol II, distinguendo i diversi fattori con lettere A, B, etc.). Come molti dei fattori generali di trascrizione, anche TFIID è, di fatto, un complesso di molte subunità. Il componente di TFIID che lega la TATA box del DNA è chiamato TBP (TATA binding protein). Le altre subunità del complesso sono dette TAF, per TBD associated factors, e si legano agli elementi del promotore, come ad esempio, l'elemento iniziatore (Inr) e l'elemento a valle del promotore (DPE). In seguito al legame con il DNA, TBP distorce, con un angolo di circa 80°, la sequenza TATA in maniera molto marcata, riconoscendo una regione estesa del foglietto β per il riconoscimento del solco minore della TATA box. Questo fornisce una piattaforma piatta per il reclutamento degli altri fattori e della polimerasi stessa sul promotore. In vitro, queste proteine si associano al promotore nel seguente ordine: TFIIA, TFIIB, TFIIF assieme alla polimerasi, e in seguito, TFIIE e TFIIH, che si legano a monte della Pol II. La formazione del  complesso pre-inizio, contenente questi componenti, è seguita dalla dissociazione dei due filamenti del promotore. Contrariamente a ciò che succede nei batteri, la dissociazione dei filamenti del promotore negli eucarioti, richiede l'idrolisi dell'ATP ed è mediata da TFIIH, che agisce nel dominio C-terminale della Pol II, quello più grande, detto CTD, costituito nell'uomo da una serie di ripetizioni della sequenza Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. È infatti l'attività elicasica di questo fattore che stimola l'apertura del DNA del promotore. Successivamente, proprio come abbiamo visto nei batteri, segue un periodo di inizio abortivo, prima che la polimerasi lasci il promotore ed entri nella fase di allungamento. Infine, negli eucarioti, l'evasione del promotore, prevede un passaggio che non avviene nei batteri, e cioè la fosforilazione della polimerasi nella sua coda. L'aggiunta di questi fosfati aiuta la polimerasi a liberarsi dei fattori generali di trascrizione utilizzati per l'inizio e che l'enzima lascia indietro appena evade il promotore. Inoltre, la regolazione dello stato di fosforilazione del CTD controlla anche i passaggi successivi, quelli che riguardano la maturazione dell'RNA.

Per avere dei livelli di trascrizione elevati e regolati, in vivo, come abbaiamo già detto, occorrono il complesso mediatore, proteine trascrizionali regolatrici e, in molti casi, enzimi che modificano i nucleosomi. Le proteine trascrizionali regolatrici, chiamate attivatori, aiutano il reclutamento della polimerasi al promotore e ne stabilizzano il legame. Spesso, l'interazione avviene con il complesso mediatore. Il mediatore è associato con la coda CTD della subunità maggiore della polimerasi attraverso una superficie di legame, mentre presenta altre superfici per l'interazione con gli attivatori legati al DNA. In dettaglio, diversi attivatori interagiscono con diverse subunità del mediatore per portare la polimerasi su geni differenti. Inoltre, il mediatore favorisce l'inizio tramite la regolazione della CTD chinasi di TFIIH. Comunque, sia il mediatore di lievito, sia quello umano, contengono più di 20 subunità, delle quali almeno 7 hanno una omologia di sequenza significativa tra i due organismi.
Una volta che la polimerasi ha iniziato la trascrizione, si passa alla fase di allungamento. Questa transizione prevede che la Pol II si liberi della maggior parte dei suoi fattori di inizio, quali, ad esempio, i fattori generali di trascrizione e il mediatore. Al loro posto viene reclutato un altro gruppo di fattori. Alcuni di questi (tipo TFIIS e hSPT5) sono fattori di allungamento. Così come per i fattori di inizio, gli enzimi coinvolti in tutti questi processi sono reclutati dalla coda C-terminale  della subunità maggiore della Pol II, il CTD. In questo caso, però, questi nuovi fattori preferiscono la forma fosforilata del CTD. Quindi, la fosforilazione del CTD provoca uno scambio tra i fattori di inizio e quelli necessari per l'allungamento e la maturazione dell'RNA. Si crede che vi siano diverse proteine in grado di stimolare l'allungamento della Pol II. Una di queste, la chinasi P-TEFb, viene reclutata sulla polimerasi dagli attivatori trascrizionali, e fosforila la serina in posizione 2 sul CTD. Questo porta all'attivazione di altre proteine, hSPT5 e TFIIS, due fattori di allungamento.  Quest'ultimo stimola il decorso generale dell'allungamento riducendo il tempo di fermata della polimerasi, in quanto quest'ultima è spesso rallentata, e, inoltre, contribuisce alla correzione da pare della polimerasi, aiutandola a rimuovere le basi errate.

Una volta trascritto, l'RNA eucariotico deve subire una maturazione prima di essere esportato dal nucleo e poi tradotto. Gli eventi di maturazione sono i seguenti: rivestimento (capping) dell'estremità 5' dell'RNA, splicing e poliadenilazione dell'estremità 3' dell'RNA. Quello più complesso è lo splicing, il processo mediante il quale gli introni non codificanti vengono rimossi dall'RNA per generare l'mRNA maturo. Il capping, invece, prevede l'aggiunta di una base guanina modificata all'estremità 5' dell'RNA. Di fatto è una guanina metilata e viene aggiunta al trascritto di RNA attraverso un legame 5'-5' insolito che coinvolge tre fosfati. Abbiano tre passaggi: nel primo passaggio, un gruppo fosfato viene rimosso dal 5' del trascritto. Poi viene aggiunto il GTP. Nel passaggio finale, il nucleotide viene modificato tramite l'aggiunta di un gruppo metile. L'RNA subisce il capping quando è lungo 20-40 nucleotidi, quando, cioè, il ciclo di trascrizione è al punto di transizione tra la fase di inizio e quella di allungamento. Dopo il capping, la defosforilazione della serina 5 all'interno del CTD della Pol II provoca la dissociazione del macchinario del capping, e un'ulteriore fosforilazione (della serina 2) porta al reclutamento del macchinario necessario per lo splicing dell'RNA. Successivamente, una volta che la polimerasi ha raggiunto la fine di un gene, incontra delle sequenze specifiche che, dopo essere trascritte nell'RNA, innescano il trasferimento degli enzimi di poliadenilazione sull'RNA, provocando tre eventi: il taglio del messaggero, l'aggiunta di molti residui adeninici alla sua estremità 3' (poli-A) e, conseguentemente, il termine della trascrizione da parte della polimerasi. Il processo avviene in questo modo, due complessi proteici sono portati dal CTD appena la polimerasi si avvicina alla fine del gene: CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) e CstF (cleavage stimulation factor). Una volta che quest'ultimi sono legati all'RNA, vengono reclutate altre proteine che, di fatto, provocano il taglio dell'RNA e poi la poliadenilazione. Quest'ultima è mediata da un enzima chiamato poli-A polimerasi, e aggiunge circa 200 adenine all'estremità 3' dell'RNA, prodotto dopo il taglio. Questo enzima utilizza l'ATP come precursore e aggiunge i nucleotidi usando la stessa chimica dell'RNA polimerasi, però lo fa senza uno stampo.

L'RNA polimerasi I, come abbiamo detto, invece, trascrive soltanto i geni per l'RNA ribosomiale a partire da un singolo tipo di promotore. Quest'ultimo consiste di due regioni separate. Il nucleo del promotore circonda il punto di inizio, da -45 a +20, ed è sufficiente per l'inizio della trascrizione. L'efficienza del promotore è però aumentata di molto dall'elemento a monte del promotore (UPE) che si estende da -180 a -107. Queste due regioni sono ricche di G:C e identiche per l'85%. Il fattore UBF1 si lega su UPE e recluta SL1. Quest'ultima consiste di 4 proteine, tra cui TBP, comune per l'inizio della trascrizione anche per le Pol II e III.
Per quanto riguarda la RNA polimerasi III, invece, i suoi promotori si dividono in due classi generali che sono riconosciuti in modo diverso da gruppi diversi di fattori. I promotori per i geni dell'RNA 5S e dei tRNA sono interni e si trovano a valle dal punto di inizio. Mentre, i promotori per i geni degli snRNA (small nuclear RNA) si trovano a monte del punto di inizio, nella posizione più convenzionale degli altri promotori. Per l'RNA polimerasi III esistono due tipi di promotori interni, ciascuno dei quali contiene una struttura bipartita, in cui due brevi elementi di sequenza sono separati da una sequenza variabile. Il tipo I consiste di una sequenza boxA separata una una sequenza boxC e il tipo 2 consiste di una sequenza boxA separata da una sequenza boxB. I promotori di tipo 3, invece, hanno tre elementi di sequenza posti tutti a monte del punto d'inizio. Comunque, i promotori interni di tipo II richiedono il legame del fattore di assemblaggio TFIIIC, che recluta il fattore TFIIIB. Quindi TFIIIC si stacca, mentre TFIIIB rimane legato vicino alla sequenza d’inizio ed è necessario e sufficiente per permettere il legame della RNA polimerasi III. TFIIIB contiene TBP. Mentre, i promotori interni di tipo 1 richiedono il legame dei fattori di assemblaggio TFIIIA e TFIIIC, che reclutano il fattore TFIIIB.