La trasposizione a DNA mediante meccanismo replicativo e Tn10

Alcuni trasposoni a DNA, però, su muovono con un meccanismo noto come trasposizione replicativa, i cui l'elemento di DNA viene replicato ogni ciclo di trasposizione. Il primo passaggio di questa trasposizione consiste nell'assemblaggio della trasposasi su entrambe le estremità del trasposone a costituire un traspososoma. Il passaggio successivo consiste nel tagliare le estremità del trasposone, in una reazione catalizzata dalla trasposasi all'interno del traspososoma. Questo taglio libera le due estremità 3' OH sulla sequenza del trasposone. Al contrario della trasposizione del tipo taglia e incolla, in questo passaggio, non si ha l'escissione del trasposone dalle sequenze dell'ospite. Le estremità 3' OH del trasposone vengono quindi unite al sito bersaglio dalla reazione di trasferimento del filamento. In questo meccanismo, però, l'intermedio che si viene a formare con il trasferimento del filamento è una molecola di DNA con una doppia ramificazione. In questo intermedio le estremità 3' del trasposone sono unite covalentemente al nuovo sito bersaglio, mentre le estremità 5' del trasposone restano unite al vecchio DNA fiancheggiante. Le due braccia di DNA sull'intermedio hanno una struttura di una forca replicativa. Dopo il trasferimento del filamento, le proteine replicative della cellula ospite si possono assemblare su queste forche e l'estremità 3' OH sul sito bersaglio di DNA tagliato serve da innesco per la sintesi di DNA. Questa reazione di replicazione genera due copie del trasposone, ciascuna delle quali è fiancheggiata da una breve ripetizione diretta del sito bersaglio. Un esempio, più dettagliato per la trasposizione replicativa ci è dato dal trasposone batterico Tn10. Questo è un elemento compatto di 9 kb che contiene un gene per la propria trasposasi ed i geni che conferiscono la resistenza all'antibiotico tetraciclina. Tn10 è organizzato in tre moduli funzionali (questa struttura è comune ad alti trasposoni detti trasposoni compositi). I due elementi più esterni detti IS10L e IS10R sono dei minitrasposoni (IS sta per sequence insertion, inserzione di sequenza). IS10R codifica per il gene della trasposasi. Tn10 limita il proprio numero di copie all'interno di una cellula con delle strategie che riducono la frequenza di trasposizione. Un meccanismo consiste nell'usare un RNA antisenso per controllare l'espressione del gene della trasposasi. Vicino all'estremità IS10R si trovano due promotori che dirigono la sintesi dell'RNA da parte della RNA polimerasi della cellula ospite. Il promotore che dirige la sintesi dell'RNA verso l'interno (detto PIN) è responsabile dell'espressione del gene della trasposasi, mentre il promotore che dirige la trascrizione verso l'esterno (POUT) serve a regolare l'espressione della trasposasi, mediante un RNA antisenso. Gli RNA sintetizzati da entrambi i promotori si sovrappongono e quindi possono formare dei legami idrogeno tra queste regioni di sovrapposizione. Questo appaiamento impedisce ai ribosomi di legarsi al trascritto che deriva dal promotore PIN, impedendo, quindi, la sintesi della trasposasi. In questo modo, le cellule con un numero di copie più alto di Tn10 trascriveranno per una maggiore quantità di RNA antisenso, che, quindi, limiterà l'espressione del gene della trasposasi. Bisogna, infine, ricordare che la trasposizione di Tn10 è accoppiata alla replicazione del DNA cellulare. Come sappiamo che i batteri, come E. coli, metilano il proprio DNA sui siti GATC. Questa metilazione avviene dopo la replicazione del DNA, in modo tale che i siti GATC siano emimetilati per pochi minuti fra il passaggio della forca replicativa e il riconoscimento di queste sequenze da parte della metilasi. E proprio durante questo breve periodo, quando il DNA di Tn10 è emimetilato, che ha luogo la trasposizione. Questo accoppiamento della trascrizione è dovuto alla presenza di due siti GATC nella sequenza del trasposone che aumentano l'affinità di legame per l'RNA polimerasi che esprime efficacemente il gene per la trasposasi.