Estrazione ed analisi di lps da Pseudoalteromonas nigrifaciens SQ02

- ESTRAZIONE PCP
L’estrazione PCP (fenolo/cloroformio/etere di petrolio) consente di estrarre le molecole di lipopolisaccaridi più lipofile come i LOS, costituiti dalla porzione lipidica A e dalla regione centrale. La miscela di estrazione viene preparata con fenolo, cloroformio ed etere di petrolio in un rapporto di volume 2:5:8 e aggiungendo fenolo solido fino ad ottenere una soluzione limpida (Galanos et al. 1969). L’estrazione del LOS si ottiene con estrazioni successive utilizzando la miscela PCP. Al termine delle tre estrazioni il cloroformio e l'etere di petrolio vengono allontanati al rotavapor, mentre al fenolo si aggiungono lentamente poche gocce di acqua per far precipitare il LOS. Il precipitato ottenuto dopo centrifugazione viene lavato con acetone, sciolto in acqua e liofilizzato. Di solito, il LOS ottenuto da questa procedura è quasi privo di acidi nucleici e contaminanti citoplasmatici.

- ESTRAZIONE ACQUA-FENOLO
L’estrazione acqua/fenolo è indicata per LPS maggiormente idrofilici, quindi per quelli che contengono la regione dell’O-chain. Viene utilizzata una miscela di fenolo e acqua in un rapporto 1:1 a 70° C (Westphal e Jahn, 1965).
Dopo la centrifugazione si osserva la formazione di tre fasi:
- una fase inferiore (fase fenolica);
- una fase intermedia costituita da materiale proteico;
- una fase superiore (fase acquosa);
La fase acquosa e la fase fenolica vengono dializzate con acqua distillata per rimuovere il fenolo residuo e infine liofilizzate. Di solito, i campioni ottenuti da questa procedura necessitano di purificazione da acidi nucleici e proteine.