Virologia molecolare:

 
 
 
Virologia molecolare
di Simone Pisu
 
Disciplina biomedica che ha come oggetto lo studio dei virus. La virologia è
determinante per il chiarimento di problemi di biologia generale e per
l’approfondimento di conoscenze in campi diversi come la struttura del gene, la
mutagenesi chimica e fisica, la ricombinazione genetica, il controllo
dell’espressione genica e delle sintesi enzimatiche, la natura di alcuni tipi di
cancro e la patogenesi di numerose malattie infettive, la ricerca sui farmaci e
sui nuovi vaccini antivirali.
 
Università: Università degli Studi di Cagliari
Facoltà: Biologia
Corso: Biologia Cellulare e Molecolare
Esame: Virologia molecolare
Docente: Prof. Marongiu1. Che cos’è un virus? 
 
Un virus è costituito da un pezzo di Rna o Dna racchiuso in un involucro proteico.  
I virus più semplici hanno soltanto un genoma, rivestito da un capside proteico, e infatti capside è il nome
che diamo a quelle proteine che formano il guscio che racchiude il genoma.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Come si sono evoluti i virus? 
I virus sono parassiti intracellulari obbligati, necessitano per potersi replicare di una cellula ospite che
supporti la loro replicazione. Non è però che vivano sempre all’interno di una cellula dove possono
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Virologia molecolare riprodursi, ma esistono anche allo stato extracellulare dove però, sono delle particelle assolutamente
quiescenti che riescono a sopravvivere: è quel momento in cui un virus, uscito da una cellula dove si era
riprodotto, è in ambiente cellulare; tutto si ferma, è metabolicamente inerte, ha la possibilità però di infettare
una nuova cellula per riprendere cosi un nuovo ciclo replicativo. 
 
 
 
 
I virus più piccoli, hanno un genoma e proteine che formano il capside. Tra di questi abbiamo: i virus
responsabili della poliomelite. Vengono chiamati nudi per distinguerli da un altro gruppo di virus che,
all’esterno del capside presentano un ulteriore rivestimento al quale diamo il nome di envelope o involucro
pericapsidico.  
Questi sono virus rivestiti, perché presentano l’envelope, rivestiti se paragonati rispetto ai virus nudi che
sono privi di questo ulteriore strato esterno che i virus acquisiscono quando fuoriescono dalla cellula ospite 
Abbiamo qui alcuni esempi, come virus rivestiti, il virus dell’epatite B, dell’influenza e l’HIV. Come virus
nudi, ossia privi di un rivestimento: il papilloma e il poliovirus.  
 
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Virologia molecolare 2. Caratteristiche salienti dei virus
 
Innanzitutto i virus sono caratterizzati da delle dimensioni estremamente ridotte, siamo nell'ordine del
nanometro, i virus più piccoli come i poliovirus hanno un diametro di circa 20 nm. I virus più grandi
arrivano ad avere una dimensione più grande di circa 500 nm. Siamo al di sotto dei limiti di risoluzione per
il microscopio ottico, di conseguenza, se noi vogliamo osservare un virus dobbiamo ricorrere a un
microscopio elettronico. 
 
Per farvi entrare in questo ordine di grandezza, 1 nm corrisponde a 10 metri, quindi delle misure
estremamente ridotte.  
Non c'è assolutamente nessuna proporzione tra una struttura cosi semplice e il guaio che possono causare. Il
più piccolo, di informazione genetica, tra i virus umani è l'epatite B, a dispetto di una pochezza incredibile
di informazione genetica per malattie epatiche associate all'infezione di questo virus: muoiono 1 milione di
persone all'anno.  
In questa diapositiva, un virus è 10 più piccolo di un pallone, il quale è a sua volta 10 più piccolo del globo
terrestre. Quindi, prima caratteristica saliente e importante per poter capire tutte le successive caratteristiche
di questi virus sono le loro dimensioni estremamente ridotte.  
 
Ma forse la caratteristica più saliente è questa, i virus sono dipendenti da una cellula vivente per la loro
replicazione: in ambiente extracellulare un virus che è quiescente, deve, trovando specifici recettori
attaccati alla cellula, entrarvi dentro e riuscire così a replicarsi.  
 
Perché un virus dipende dalla cellula ospite?  
Perché, innanzitutto manca di quelli che sono gli elementi base necessari per la replicazione e che sono
invece presenti in tutte le cellule che, al contrario, sono capaci di farlo.
Il virus manca di quegli enzimi che sono indispensabili per la sintesi, di tutti quei precursori che partecipano
alle sintesi macromolecolari, i virus non sanno sintetizzare nucleotidi, non sanno sintetizzare carboidrati,
non sanno sintetizzare lipidi ne tanto meno amminoacidi, ecco che questo è un motivo fondamentale per il
quale il virus dice alla cellula “aiutami vienimi incontro perché certo io non posso affrontare una sintesi
proteica se non so prepararmi tutti quei mattoni che sono indispensabili per affrontare un simile processo”.
Sono privi di tutti quei sistemi enzimatici che generano, normalmente sottoforma di ATP, energia chimica
utilizzabile, ecco che ancora una volta il virus ricorre alla cellula per produrre tutta quella energia che serve
per lo svolgimento delle sintesi virus specifiche. Manca di ribosomi, di RNA transfer, come pure di tutto
quel macchinario enzimatico che è indispensabile perché all'interno di una cellula si sintetizzi una proteina.
Manca di membrane, che sono la sede di tutte le sintesi macromolecolari normalmente realizzate all'interno
di una cellula. Tutti e 5 motivi fondamentali che ci spiegano perché un virus all'esterno di una cellula è
incapace di andare incontro a qualsiasi tipo di sintesi macromolecolare. 
 
Un'altra caratteristica è che un virus penetrato in una cellula, che vuole intraprendere un proprio
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Virologia molecolare processo replicativo, perde la propria integrità. Sapete dalla microbiologia, quando vi ho detto parassiti
intracellulari obbligati che questa non è una caratteristica unica dei virus, ci sono anche cellule batteriche
come per esempio le clamidie che replicano solo all'interno di una cellula. Ma che caratteristiche hanno
questi procarioti? Vivono all'interno di una cellula ma sono capaci di una crescita alla quale segue una
normale divisione in due cellule figlie, sono microrganismi che nel loro processo di crescita che culmina in
un processo di divisione, non perdono la loro integrità.  
 
Ben diverso è il comportamento dei virus: subito dopo che un virus è riuscito a penetrare all'interno di una
cellula, o proprio durante questo processo di penetrazione, il virus in un processo chiamato UNCOATING
si spoglia, si ha separazione tra il genoma e quelli che sono i rivestimenti superficiali del virus. Ecco che, a
questo punto, il genoma virale diventa la centralina che dirige la replicazione e la formazione di una nuova
progenie virale.  
E che sintesi dovrà dirigere, questo genoma, per arrivare alla formazione di nuove particelle virali?
 Deve fare due cose: tanti nuovi genomi e tante nuove proteine strutturali che, in una tappa, che poi è la
tappa finale del ciclo replicativo si assemblano insieme per formare nuove particelle virali. 
 
 
Lo vediamo meglio nella successiva diapositiva, a sinistra abbiamo una tipica curva di crescita di una cellula
batterica: inizia con un periodo di latenza nella quale la cellula batterica si fornisce tutte le attività
enzimatiche che sono indispensabili alla sua crescita e successiva divisione. Una volta che questo è
realizzato abbiamo, una fase esponenziale, nella quale le cellule batteriche replicano, fino a che, esauriti i
nutrimenti a disposizione si entra in una fase stazionaria che precede l’ultima fase che è quella di morte. In
tutte queste fasi la cellula batterica è una cellula completa integra che, quando cresce e si divide nella fase
esponenziale da una cellula se ne originano altre due.  
Completamente diverso il comportamento replicativo da parte di un virus, ovviamente tutte le volte che
voglio coltivare un virus in laboratorio devo avere a disposizione cellule. Nessun tipo di terreno ha la
possibilità di supportare la replicazione di questi microrganismi essendo intracellulari obbligati.  
 
Cosa succede quando io infetto delle cellule con un virus?
Lascio passare un certo periodo, pochi minuti, frammento quelle cellule, le apro, per vedere quello che c’è
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Virologia molecolare dentro, non trovo più particelle virali complete. Il virus a seguito dell’uncoating si è svestito, vedo che
questo periodo dura un certo tempo prima che si possano di nuovo riscontrare in quella cellula particelle
virali complete.  
Che cosa fa il virus in questo periodo di latenza?  
Vuole fare tanti nuovi genomi e sintetizzare proteine capsidiche, poi le acchiappa le mette insieme e si
formano nuove particelle virali. Cosa vuole fare? Prima di tutto deve pensare a procurarsi quegli enzimi che
gli servono per duplicare il proprio dna, e anche quelle attività enzimatiche che gli consentono di contrattare
la cellula. Cosa vuol dire contrattare? Il virus entra all’interno di una cellula e dice, a questo punto la
centralina di questa cellula che detta ordini è il mio genoma. Molto spesso un virus deve aver evoluto delle
modalità che gli consentono di prendere il sopravvento su quelle che sono le sintesi molecolari della cellula
ed è quello che fa con quelle che sono le proteine virali precoci. Dopo di che pensa a replicare il proprio
genoma, quando ha replicato il proprio genoma sullo stampo di questi nuovi genomi si sintetizza le proprie
proteine capsidiche ed eventuali altre proteine strutturali. A questo punto ha a disposizione nuovi genomi,
nuove proteine strutturali ed ecco che il periodo di latenza finisce, avviene l’assemblaggio, e nuove
particelle virali, potranno, se noi tramutiamo quella cellula prima che il virus sia fuoriuscito in ambiente
extracellulare, ritroviamo nuovamente particelle virali.  
 
Osserviamo le fasi dell’infezione del fago T4. È un batteriofago, ossia un virus che ha come ospite una
cellula batterica, che realizza il proprio ciclo replicativo in 25 minuti ma lo fa con una intelligenza che lascia
sbalorditi, si è organizzato per fare ogni cosa al momento opportuno. È importante sottolineare come un
microrganismo cosi piccolo possa, passo dopo passo, fare tutto quello che gli serve e, una volta per esempio,
quando una attività enzimatica ha cessato di essergli utile ne stoppa la produzione.  
 
Il virus è utilizzato, quindi, per infettare la cellula ospite. Si tratta di cellule di E.coli e cosa fa nella fase di
latenza, nella quale se noi rompiamo quell’E.coli non vediamo più batteriofagi integri? Penetra nella cellula
solo il genoma, il quale sintetizza prima degli Rna messaggeri che chiamiamo precoci, che servono al virus
per duplicare il Dna genomico. Dopodiché con una serie di messaggeri che portano alla sintesi di proteine
intermedie, è pronto per duplicare il proprio Dna. Una volta che, tanti nuovi genomi si sono formati, questi
fungono da stampo per la formazione di messaggeri tardivi, che portano l’informazione per la sintesi delle
proteine strutturali. Una volta che avremmo tanti nuovi genomi e tante nuove proteine strutturali segue
l’ultima fase, l’assemblaggio, alla quale seguirà lo scoppio, perché il virus produce lisozima, dell’E.coli, e il
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Virologia molecolare riversarsi in ambiente extracellulare di una nuova progenie virale.  
 
Abbiamo parlato di dimensioni dell'ordine dei nanometri, e sottolineato la peculiarità di un ciclo replicativo
durante il quale un virus perde la propria integrità, altra cosa importante è che i virus hanno un genoma
costituito o da Dna o da Rna mai entrambe queste molecole presenti contemporaneamente.  
Cosa significa questo? Noi sappiamo bene che il flusso di informazione genetica va da Dna a Dna, da Dna a
Rna, dall'Rna alle proteine, ciò significa: un virus con genoma costituito da Dna, una volta che è all'interno
della cellula, può inserirsi tranquillamente in quello che è il normale flusso di informazione della cellula. I
virus con genoma costituito da Rna si trovano a dover affrontare un grosso problema per la loro espressione.
La cellula ospite, per formare dei messaggeri, utilizza un Rna polimerasi Dna dipendente, un virus che ha un
genoma a Rna non può utilizzare questa attività enzimatica. La cellula non gli può venire incontro perché,
essendo il flusso dell'informazione Dna-Rna-Proteine, la cellula non utilizza una Rna polimerasi Rna
dipendente. Il virus codifica una Rna polimerasi Rna dipendente che, consente al genoma di potersi
esprimere.  
 
(Quando studiate dovete sempre chiedervi: se il genoma del virus sia a Rna o Dna e quanto Dna o Rna
abbia.) 
 
I virus a Dna (deossiribo virus) e i virus a Rna (ribovirus) possono avere un genoma a singola catena o a
doppia catena. Una classe particolare di virus, i Retrovirus e i virus dell'epatite B, hanno l'informazione
genetica contenuta in Dna o Rna ma in diversi momenti del ciclo di replicazione virale. L'esempio classico
di retrovirus è l'HIV: il genoma è costituito da un Rna lineare, possiede una particolare attività enzimatica
che è la trascrittasi inversa, cosi il genoma a Rna, durante il ciclo di replicazione di questo virus, viene
convertito in Dna che poi va a integrarsi nel cromosoma della cellula ospite. Il virus dell'epatite B fa
esattamente il contrario: ha un genoma costituito da Dna, nella particella virale completa e infettante ma, nel
corso del ciclo replicativo, il virus ha scelto come via evolutiva quella di trasferire la sua informazione dal
Dna all'Rna. Dopo aver visto che genoma contiene quel virus andiamo a vedere quanta informazione questo
virus contiene. I Dna virus hanno un'informazione che va da 3,2 a 200 Kbp quindi enorme varietà. Gli Rna
virus hanno un'informazione che va da 1,7 a 27 Kbp. 
 
Perché è importante riflettere sulla quantità di informazione che un virus contiene?  
Un virus molto piccolo, 20 nm di diametro, ha un'informazione genetica di soltanto 2000 nucleotidi. È un
virus che ha un'informazione genetica talmente scarsa che, soltanto sintetizzando due proteine è in grado di
terminare la propria replicazione. All'estremo opposto, un virus grande (esempio del mimivirus), circa 500
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Virologia molecolare nm di diametro, 1,2 milioni di nucleotidi, ha la possibilità di sintetizzare 1200 proteine. 
È importante avere questa informazione perché, immediatamente vi dice che le strategie replicative di
questo piccolo virus, paragonate rispetto a quello più grande, saranno profondamente, tra loro, differenti.   
Qui, stiamo analizzando un virus, mi viene in mente il fago MS2 che, per realizzare la propria sintesi è
dipendente, in maniera massiva dalla cellula ospite. Questo virus, più ricco di informazione genetica, che
scende in campo con molte proteine virali, sarà molto meno dipendente e potrà arrivare, per esempio, ad
aumentare il proprio genoma in maniera indipendente dalla cellula ospite.  
 
Cosa voglio dire con duplicare in maniera autonoma il proprio genoma?  
Non soltanto per la sua polimerasi ma per tutte quelle attività enzimatiche che gli servono per duplicare il
proprio genoma. 
Quindi è importante la valutazione della quantità del Dna o Rna, e ricordiamo il problema che devono
risolvere gli Rna virus: hanno un template di Rna, entra una molecola di Rna nel citoplasma di una cellula,
la cellula non gli offre nessuna Rna polimerasi Rna dipendente, però il virus non ne può fare a meno. Non ne
può fare a meno per due motivi: questa attività enzimatica gli serve per copiare l'Rna genomico e fare tanti
nuovi Rna genomici, in parole più corrette deve duplicare il proprio genoma, come pure gli è indispensabile
per sintetizzare i propri Rna messaggeri. Abbiamo visto come, la stragrande maggioranza dei virus codifica
per una propria Rna polimerasi Rna dipendente che è in grado di consentire al virus entrambe queste
funzioni: duplicare il proprio genoma e sintetizzare i propri Rna messaggeri indispensabili alla realizzazione
di un ciclo replicativo.  
È importante sapere, all'inizio dello studio di un virus, quantità ecc, anche perché ci da un'idea di quella che
è la capacità di questo virus di evolversi.  
 
 
 
 
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Perché abbiamo un diverso ritmo di capacità evolutiva tra gli Rna, che sono rapidissimi e i Dna che
ovviamente hanno un ritmo ben inferiore?  
Dipende, dalla serietà con cui lavorano gli enzimi che sono preposti alla replicazione degli acidi nucleici.  
I Dna virus duplicano ricorrendo a una Dna polimerasi Dna dipendente. Questa è un'attività enzimatica
precisa, che svolge bene il proprio lavoro che addirittura, che se compie un errore, è capace di fermarsi e
tornare indietro per correggere. A dispetto di questo è anche vero che, la Dna polimerasi, ogni 10 - 10^11
basi che aggiunge compie un errore. Si ha l'insorgenza di mutazioni e queste mutazioni sono uno degli
avvenimenti principali che concorrono al processo evolutivo dei virus.  
 
Come funziona una Rna polimerasi Rna dipendente?  
È priva della possibilità di correggere errori, è un enzima paragonato alla Dna polimerasi che, in maniera più
semplicistica possiamo dire che è più arrafazionale(?). Arriva a compiere un errore ogni 10^3 - 10 paia di
basi. Ecco che, i virus a Rna, a seguito di questo tasso mutazionale così elevato mutano con estrema velocità
(con conseguenze molto importanti per l'ospite). 
 
Tenete presente che questa situazione ha delle ripercussioni molto importanti sotto vari aspetti.  
Anche la trascrittasi inversa, che i retrovirus utilizzano per convertire l'informazione genica da Rna a Dna,
che poi viene integrato nel cromosoma ospite, anche questo, come la Rna polimerasi Rna dipendente, è un
enzima piuttosto impreciso: ha lo stesso valore per quanto riguarda gli errori durante il funzionamento, un
errore ogni 10^3 - 10 basi aggiunte. Il genoma dell'HIV, che nel corso della propria replicazione utilizza una
trascrittasi inversa con questo tasso mutazionale, ha un genoma costituito da 10 ribonucleotidi. Ogni volta
che la trascrittasi inversa legge, o meglio copia questo genoma a Rna per formare una molecola di Dna,
inserisce per lo meno un errore. Se noi pensiamo che in un individuo infetto da HIV, si può arrivare ad avere
la produzione di 10^11 particelle di HIV ci rendiamo conto dei mutanti che insorgono in un solo ciclo di
replicazione nelle 24 ore. Questo giustifica la difficoltà ad ottenere un vaccino, lo stesso è vero per un
farmaco.
 
Non è solo importante per l'insorgenza e per i risvolti di una malattia, il funzionamento delle polimerasi ma:
il vaccino antipolio, ne abbiamo a disposizione due, il vaccino di Salk con il virus inattivato e il vaccino di
Sabin che è invece un virus attenuato ossia un virus vivo che ha perso il proprio potere patogeno. Quando ad
un bambino sano viene somministrato questo vaccino di Sabin abbiamo che il virus attenuato replica
nell'intestino di questo bambino, suscita quindi una risposta anticorpale efficace nel proteggere quel
bambino quando incontrerà il wild type, ossia il ceppo selvaggio della malattia, però il sistema immunitario
di questo bambino è valido e quindi nell'arco di un mese, un mese e mezzo, elimina il principio vaccinante,
il virus attenuato ha stabilito una bella immunità e tutto è andato liscio.
 Cosa succede se questo vaccino viene somministrato ad un bambino molto piccolo che presenta problemi al
sistema immunitario con immuno-deficienza?  
In questo bambino il sistema immunitario non è capace di debellare il virus, il virus attenuato continua a
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Virologia molecolare replicarsi. Questo cosa comporta? Il Poliovirus è un virus a Rna e affida la propria replicazione ad una Rna
polimerasi Rna dipendente estremamente inaccurata, si allunga il periodo di sopravivenza del virus nel
bambino vaccinato, aumenta la possibilità che a seguito di errori della polimerasi il ceppo che ha perso la
propria virulenza, abbia, per mutazione la probabilità di ritornare ad essere nuovamente virulento. 
 
 
 
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Virologia molecolare 3. Virus e malattie umane
 
 
 
I virus sono importanti cause di malattie e qui c’è il riassunto in questa tabella.
 
Possono parassitare tutte le forme di vita, abbiamo l’uomo, animali, funghi, piante, protozoi, batteri, sono
tutte cellule che possono fungere da ospiti per la replicazione di un virus. Le infezioni virali nelle piante e
animali, soprattutto quelli commestibili, hanno un effetto sull’economia umana, per questo si cerca un
farmaco o vaccino.  
 
Ma non pensiamo ai virus solo come microrganismi estremamente cattivi in grado di mettere a repentaglio
la nostra salute, essi svolgono anche un ruolo importante nell’intero nostro sistema. È stato fatto un calcolo
che, i batteriofagi che sono i virus che hanno una morfologia complessa, dotati di coda, raggiungono un
numero pari a 10^31, una quantità enorme. Ciascun batteriofago è lungo 200 nm. Se noi prendiamo questo
10^31 batteriofagi e mettiamo in fila, hanno calcolato che copriamo una lunghezza pari a 2 x 10^21
chilometri, è una distanza che poi ci porta alle più lontane galassie. Un’altra considerazione è che circa il
98% della popolazione che vive negli oceani è formata da microbi, ed è all’attività fotosintetica di questi
microbi che si deve la formazione di circa il 50% dell’ossigeno che è presente nella nostra atmosfera. È stato
calcolato che, i virus presenti negli oceani, distruggono ogni giorno circa il 20% della popolazione
microbica. Di conseguenza i virus svolgono un ruolo importante sia nel ciclo del carbonio, sia nel regolare il
tasso dell’ossigeno presente nella nostra atmosfera. Quindi hanno un fondamentale ruolo nell’intero nostro
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Virologia molecolare sistema.  
 
Lo studio dei virus ha dato molte informazioni per la biologia molecolare, per esempio con lo studio dei
virus si sono scoperti gli oncogeni che svolgono un ruolo fondamentale nel regolare la crescita cellulare e
partecipare al differenziamento, individuati i promotori riconosciuti dalle Rna polimerasi nelle cellule
procariotiche, scoperti gli enzimi che partecipano alla replicazione del Dna, scoperto il processo di Rna
splicing fondamentale nella formazione degli Rna messaggeri.  
 
Ogni volta che noi studieremo un virus ci porremmo queste tre domande, che rispondono ai problemi che i
virus devono risolvere per potersi replicare. 
 
Il primo problema è come riuscire a riprodursi una volta che si trova all’interno di una cellula. Il secondo
problema, uno dice un virus infetta, replica fa una progenie virale, però deve essere anche in grado di
trasmettersi da un individuo ad un altro per avere aperta la strada che porta alla sua evoluzione. Terzo
problema, quando un organismo è infettato da un virus, l’organismo non è che rimane li vittima
dell’infezione virale, ha a disposizione un sistema immuno-competente che reagisce all’infezione del virus
con l’obbiettivo di controllarla ed eliminarla. I virus però si sono fatti furbi e hanno messo in atto strategie
per contrastare le nostre difese naturali. Questo sarà lo schema sul quale imposteremo lo studio di un virus.  
 
Il primo problema, vi ripeto, è come riprodursi quando entra in una cellula. Vuole produrre una nuova
popolazione virale che poi riversa in ambiente extracellulare. 
Il virus, allo stato extracellulare, trova dei recettori nella superficie della cellula ospite, per poi poter entrare
nella cellula, il virus entra attraverso un processo di endocitosi (la membrana citoplasmatica, per il legame
con i recettori, si invagina) e si viene a ritrovare all’interno di una vescicola di fagocitosi nel citoplasma.
Comincia il processo di svestizione chiamato uncoating che ha come punto d’arrivo la liberazione
dell’acido nucleico. L’acido nucleico virale, a questo punto deve ricorrere all’aiuto, nella cellula vuole
compiere un processo di trascrizione per arrivare alla sintesi dei propri messaggeri come pure gli serve un
apparato proteino-sintetico per sintetizzare le proteine virus specifiche. Quindi, per i processi di trascrizione
e di traduzione, chiede aiuto alla cellula ospite. Una volta che si sono sintetizzati gli enzimi che servono alla
loro replicazione ecco che il virus può formare tanti nuovi genomi, che combinandosi con le proteine
strutturali vanno ad assemblarsi all’interno della cellula, si formano nuove particelle virali che poi vanno
rilasciate in ambiente extracellulare. Vi ho detto (diapositiva 1) che alcuni virus sono nudi e che altri hanno
un rivestimento esterno envelope o involucro pericapsidico, questo envelope è acquisito dalla particella
virale durante la fuoriuscita dalla cellula ospite. Nella diapositiva 22 si vede che il virus entra per endocitosi,
si libera della vescicola endocitica, rimozione del capside ed esposizione dell’acido nucleico. Cosa deve
fare? Tante copie, tanti nuovi genomi, tante nuove proteine strutturali. Genomi e proteine strutturali si
assemblano, nel processo di maturazione si formano nuove particelle virali che portano alla vestizione della
cellula (questo è un virus …. non tutti i virus fanno questo) ed ecco la progenie viene formata e si libera in
ambiente extracellulare. 
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Siamo al primo problema che il virus deve risolvere, come replicare una volta che è penetrato all’interno di
una cellula ospite. Perché la replicazione abbia luogo un virus deve essere in grado di presentare al
macchinario proteino-sintetico della cellula, uno o più RNA-messaggeri che la cellula possa riconoscere e
tradurre nelle relative proteine. Si arriva così alla sintesi delle proteine virali.  
 
Per raggiungere questo obiettivo, un virus deve essere in grado di superare alcuni ostacoli imposti dalla
organizzazione della cellula ospite: 
 
1. Nella cellula eucariotica, gli RNA messaggeri vengono sintetizzati nel nucleo, per trascrizione del DNA
ad opera della RNA polimerasi-DNA dipendente. 
Quale virus può infettare una cellula e tranquillamente inserirsi in questa strada?  
I virus che hanno un Dna però devono saper arrivare nel nucleo, sono i cosiddetti Dna infettanti. Io prendo
una particella virale, la spoglio di tutti i rivestimenti, prendo l’acido nucleico e artificialmente lo faccio
entrare nella cellula, raggiunge il nucleo che è il punto di partenza per la formazione di nuove particelle
virali. Abbiamo il virus del vaiolo a Dna, che ha scelto, pur avendo un genoma a Dna, di replicare nel
citoplasma e non può andare nel nucleo.  
Cosa serve quindi per fare i messaggeri?  
Una Rna polimerasi Dna dipendente e parte della particella virale. Quando il virus del vaiolo infetta la
cellula, in questa cellula entra non soltanto il genoma virale, ma anche l’Rna polimerasi Dna dipendente
indispensabile a quel virus che sintetizzerà nel citoplasma i propri Rna messaggeri.  
Un altro problema è che un virus deve chiedere enzimi in prestito alla cellula per duplicarsi, un apparato
proteino sintetico, in particolare, nel caso dei Dna virus cosa gli serve? Serve una Dna polimerasi dna
dipendente, delle…., delle …. Chinasi, la cellula gli deve dare tutto questo. La cellula gli può dare tutto ciò
quando è in attiva replicazione, se una cellula è …. il virus si trova in difficoltà. Tutte le cellule differenziate
hanno cessato di esprimere le attività enzimatiche implicate nella duplicazione del Dna, ecco che i virus
hanno risolto questo problema con due modalità diverse. Un esempio è quello di Herpes virus instaurano
latenza nelle cellule nervose.  
Le cellule nervose duplicano il loro Dna? No! Sono cellule altamente differenziate. Quando il virus infetta
quella cellula lo fa perché vuole instaurare latenza, vuole rimanere nascosto per sfuggire al sistema
immunitario, però ogni tanto quell’Herpes virus si risveglia e ha bisogno di tutto quel corredo enzimatico
che provvede alla sintesi di Dna. La cellula nervosa non glielo offre ed ecco che nel genoma dell’Herpes
troviamo l’informazione che porterà a tutti quegli enzimi che sono indispensabili al virus a duplicare il
proprio genoma. In altre parole, ha l’informazione genetica sufficiente perenne nella propria replicazione,
indipendente da quella della cellula. Altri virus, purtroppo per noi, hanno scelto una strada diversa: 
 
2. Replicazione in cellule “resting” 
Questo Dna virus è in crisi e da un calcio a quella cellula e la costringe a riprendere il suo ritmo replicativo e
questi sono i cosiddetti virus oncogeni in grado di trasformare la cellula. Quest’ultima è quiescente e i virus
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Virologia molecolare danno una spinta alterandone i meccanismi di controllo, ed ecco che quella cellula rientra in fase S e
ricomincia a sintetizzare quelle attività enzimatiche indispensabili al virus. 
Un altro problema serio è che noi stiamo parlando di virus animali, virus che infettano una cellula
eucariotica e sappiamo che: 
 
3. Il macchinario proteino-sintetico della cellula eucariotica è predisposto esclusivamente per la traduzione
di messaggeri monocistronici. 
Cosa vuol dire monocistronico? Un messaggero porta l’informazione per un’unica proteina. Quel
messaggero ha un unico punto di contatto con il ribosoma e il risultato è un’unica proteina. Diversamente le
cellule procariotiche hanno rna policistronici, più punti del messaggero possono prendere contatto con il
ribosoma e la conseguenza è che quel messaggero porta l’informazione per più proteine. Quindi il virus deve
risolvere questo problema: se sintetizza un rna messaggero che porta l’informazione di più proteine la
cellula eucariotica non lo può aiutare. 
Altro problema molto importante, il virus in qualche maniera riesce a sintetizzare i propri messaggeri, questi
messaggeri ovviamente, sono in competizione, a livello dei ribosomi, con una miriade di messaggeri
cellulari: 
 
4. Nella cellula infetta l’espressione dei geni virali è in competizione con una miriade di geni cellulari che
vengono contemporaneamente trascritti e tradotti. 
Il virus deve dire ai messaggeri cellulari di andare via, l’apparato proteino sintetico ora serve a lui, perché
vuole sintetizzare proteine virali. 
 
Gli rna virus, abbiamo detto che, in assenza di una Rna polimerasi Rna dipendente nella cellula, codificano
informazione per sintetizzare questa attività enzimatica indispensabile alla loro replicazione. 
 
Ecco la classificazione di Baltimore dei virus: 
 
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Abbiamo virus a Dna a singolo e a doppio filamento, virus a Rna a singolo e doppio filamento ed i
retrovirus.  
Il nocciolo è questo: entra un virus in una cellula, il genoma può essere a Dna o Rna, che cosa deve fare
questo virus per prima cosa?  
Vuole tanti nuovi genomi e tante nuove proteine capsidiche, quindi deve sintetizzare gli Rna messaggeri, è il
punto di partenza in tutti i casi.  
Quindi, che tipo di Dna c'è? Quanto Dna c'è? Ha un elevato tasso mutazionale? Quindi, dove si colloca il
virus che stiamo studiando nella classificazione di Baltimore.  
 
Sono sette classi: 
• Virus a Dna bicatenario: sono i più fortunati, perché sono capaci di arrivare nel nucleo, hanno a
disposizione dalla cellula tutto quello che gli serve per arrivare alla sintesi di un messaggero. Questo Dna
bicatenario va nel nucleo, c'è una Dna polimerasi dna dipendente che la cellula gli offre e la utilizza, così
molto facilmente arrivano alla sintesi del messaggero.  
• Virus a Dna a singola catena: deve prima di tutto duplicarsi. Dapprima i virus provvederanno a duplicare
il proprio Dna e poi loro arriveranno alla sintesi dei messaggeri. 
• Virus a Rna a polarità positiva (Rna +): l'esempio è il poliovirus. Con il + si indica che questo rna è già
un Rna messaggero, riconosciuto dai ribosomi. Il genoma  e il ribosoma hanno lo stesso segno, il polio entra
prende contatto con i ribosomi e realizza velocemente la sintesi delle proprie proteine.  
• Virus a Rna a polarità negativa (Rna -) e virus a Rna a doppia catena: entra un rna che non può
fungere da messaggero cioè non è riconosciuto dai ribosomi, e la cellula non gli può dare nulla in prestito.
Dovranno avere presente nella particella virale, una Rna polimerasi Rna dipendente. Grazie alla presenza,
nella particella virale, di questa attività enzimatica, questo Rna verrà dapprima trascritto (prima sintesi
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Virologia molecolare macromolecolare). L'rna a polarità negativa verrà copiato per arrivare alla sintesi di un Rna messaggero e
arrivati a questo punto si potrà sintetizzare le proprie proteine tranquillamente. La stessa strategia viene
utilizzata per l'rna a doppia catena, entra nella cellula e nel citoplasma, grazie all'attività enzimatica che si è
portato dietro, potrà essere trascritta la catena di segno meno per arrivare ad un Rna messaggero a polarità
positiva.  
• Retrovirus: è un Rna a polarità positiva, potrebbe fungere direttamente da messaggero ma ha scelto una
strada differente. In questo virus è presente una trascrittasi inversa che copia il genoma a Rna a singola elica,
trasformando in un intermedio a Dna bicatenario. Una volta che si è formato questo Dna sotto forma di
provirus va a integrarsi nel cromosoma della cellula ospite. Rna monocatenario, grazie alla trascrittasi
inversa formazione di un Dna bicatenario e sua integrazione nel Dna dell'ospite. Il Dna integrato potrà
essere trascritto dalla Rna polimerasi dna dipendente della cellula ospite, per arrivare alla formazione di
messaggeri.
 
I virus però non possono limitarsi a infettare solo un individuo, perché con la morte di quell'individuo
morirebbe anche il virus. Deve quindi risolvere il problema di trasmettersi da un individuo a un altro. Che
strada ha imparato il virus? Ha imparato strade che riflettono quelli che sono normali comportamenti
dell'uomo, si trasmettono con una stretta di mano, con un colpo di tosse, con un rapporto sessuale sono
queste legate al comportamento che i virus utilizzano per passare da un individuo a un altro. Ma non deve
solo trasmettersi da un individuo all'altro, quando arriva in un nuovo individuo deve essere capace di trovare
la strada che lo porta alle cellule nelle quali può replicarsi. Non tutte le cellule del nostro organismo sono
sensibili ai virus, i virus invece sono altamente specifici nel tipo di cellule all'interno della quale
riescono a replicare. Alcuni virus riescono a replicare solo in un tipo di cellule, altri hanno uno spettro più
ampio ma è sempre limitato il numero delle cellule all'interno delle quali il virus può realizzare il proprio
ciclo replicativo.
 
Il terzo problema è abbastanza serio per i virus, una volta che cominciano l'infezione, il nostro sistema
immuno-competente cerca di eliminare questa infezione, il nostro sistema immunitario escogita qualcosa di
nuovo per difendersi ed ecco che il virus immediatamente trova il modo di sovrastare questa nuova difesa
dell'ospite. Si crea una sorta di bilanciamento, il virus non vuole portare a morte l'ospite e se cosi fosse
velocemente l'ospite andrebbe a estinguersi e cosi si abbasserebbe, per il virus, la probabilità di
sopravvivere, muore l'ospite e muore anche il virus. Si crea una sorta di battaglia a tutt'oggi aperta, il sistema
immunitario fa un passo avanti e il virus cerca di scavalcare. Ricordiamo ancora una volta dell'elevato tasso
mutazionale che caratterizza i virus che porta all'insorgenza di nuove varianti, quella che meglio si adatta al
particolare ambiente. Per esempio il virus dell'influenza cambia il suo vestito superficiale perché così gli
anticorpi sintetizzati l'anno scorso non hanno più alcun effetto così il sistema immunitario deve sintetizzarne
di altri.  
 
Le malattie che i virus causano sono la conseguenza del modo con cui un virus ha scelto di risolvere i tre
problemi della riproduzione, della trasmissione e dell'evasione dall'ospite.  
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Virologia molecolare Questo significa che, una volta che capiamo come un particolare virus risolve questi tre problemi saremmo
anche capaci di predire le conseguenze patologiche di quella infezione virale.  
 
Perché un virus causa malattia? 
In molte occasioni è la conseguenza dell'infezione virale, un virus infetta alcune cellule del nostro
organismo e le distrugge portandole a morte. In altri casi invece, la malattia virale è la conseguenza di una
reazione dell'ospite che è troppo marcata, il sistema immunitario interviene per cercare di arginare
l'infezione virale ma una risposta marcata diventa la causa di malattie.  
 
Ho suddiviso i virus che vedremmo secondo le modalità di trasmissione in quattro gruppi:  
• Per via respiratoria: influenza, rhinovirus (del raffreddore), measles (del morbillo). 
Vedremmo i cicli replicativi e come questi qua si difendono dall’ospite. 
• Per via alimentare: rotavirus, adenovirus, epatite A. 
• Per via materno-fetale: epatite B, epatite C, HTLV1 (virus della leucemia cellule T dell’adulto). 
• Per via sessuale: HIV, herpes simplex, papilloma. 
 
Abbiamo concluso la lezione della scorsa settimana esaminando tre problemi che il virus, all'interno della
cellula, deve necessariamente risolvere.  
1. Il primo problema deve essere in grado di riprodursi in particolare come punto centrale dalla modalità con
cui il virus si introduca come rna messaggero.  
2. Il secondo problema è che una volta ospitato all'interno di una cellula di un dato organismo, deve essere
in grado di trasmettersi da un individuo ad un altro per assicurarsi di proseguire il proprio processo.  
3. Terzo problema una volta che un organismo è infettato da un virus non rimane inattivo a subire l'infezione
virale ma ha un sistema di difesa chiamato sistema immuno-competente ed ecco che i virus hanno elaborato
delle sofisticate misure per contrastare le nostre difese. Proprio perché è cosi importante conoscere come un
virus si difende dall'ospite, la lezione di oggi sarà dedicata a una carrellata sulla risposta immunitaria.
Sono conoscenze che già avete dal corso di microbiologia generale ma è importante avere chiari, impressi
nella mente, quali sono i momenti salienti e determinanti in quella che è la risposta immunitaria nei riguardi
dell'infezione virale. Nello svolgimento del corso esamineremo tantissimi virus, le modalità messe a punto
da questa classe cosi peculiare per contrastare le difese immunitarie.  
 
Le difese dell'ospite sono organizzate in tre strati: una barriera chimica superficiale che ha il compito,
essendo in superficie, sarà quella esposta ad un numero maggiore di virus, è una barriera di tipo chimica che
può essere con una certa facilità superata. Il secondo strato è quello dell'immunità innata, presente alla
nascita in tutti gli animali, ha quattro armi di difesa. Quando il secondo strato viene superato scatta una
difesa molto forte che è quello rappresentata dall'immunità adattativa che comprende sia una risposta
umorale che una risposta di tipo cellulo-mediata.  
 
Potete anche vedere da questa prima diapositiva, questi sono i virus invasori, sicuramente il contagio, ogni
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Virologia molecolare strato ha una propria efficacia resistente al nostro organismo, il passaggio da uno strato all'altro vedete come
decresce il numero dei virus infettanti. Una barriera fisico chimica molto efficace, lo vedremo tra poco, a
livello della cute una cute integra dice al virus tu non passi, basta la mia presenza per ostacolare il processo
infettivo. Lacerazione della cute scatta immediatamente la risposta innata. Per alcune infezioni virali, come
quelle da endovirus è sufficiente nelle maggior parte dei casi una risposta innata senza chiedere aiuto alla
risposta adattativa per risolvere l'infezione. Comunque rimane di fondamentale importanza che anche
l'immunità innata può non essere sufficiente alla risposta immunitaria, ecco però che abbiamo a nostra
disposizione l'immunità adattativa le cui caratteristiche le descriveremo tra poco.  
 
Vediamo una carrellata di quelle che sono le barriere fisiche; la cute integra è un ottima difesa perché tutto
dipende dalla sua organizzazione negli strati più superficiali sono presenti delle cellule piene di cheratina,
sono cellule morte, sapete molto bene che i virus per replicarsi hanno bisogno di cellule vive e la presenza di
cellule morte fa si che questa non sia una strada aperta all'infezione virale. Quando la cute viene lesionata o
in seguito ad una puntura di insetto i virus possono raggiungere gli strati più interni, i tratti basali, dove
cellule vive consentono al virus di replicarsi. Se la pelle è una buona difesa, sarà ancora più facile per i virus
realizzare un infezione tramite le mucose, mucose respiratorie sono rivestite da un epitelio cigliare rivestito
da muco, ecco che queste ciglia muovendosi, se un virus è penetrato nelle vie respiratorie , rimuovono verso
le parti alte delle vie respiratorie dove possono essere eliminate nell'ambiente esterno con un colpo di tosse.
È importante anche il rivestimento del muco perchè il virus per iniziare un processo infettivo deve trovare
nelle cellule dei recettori e questo muco riveste questi recettori e il virus non può svolgere la prima fase del
ciclo replicativo rappresentata dalla fase di attacco tra anti-recettore virale e il recettore che è presente sulle
cellule ospite. Sono barriere che il virus riesce a superare, sono molti i virus che riescono a superare questi
ostacoli.
 
La mucosa del tratto digestivo cerca di opporsi ad un infezione virale, se il virus penetra nella bocca già
nella saliva sono presenti anticorpi antivirali, il bacio ad esempio non è un veicolo di trasmissione del virus
dell'HIV perchè nella saliva sono presenti virus delle proteasi che entrano nel ciclo di replicazione dell'HIV
e già a livello della bocca il virus viene bloccato della propria (…). Se riescono a superare la bocca arrivano
nello stomaco e trovano un ambiente drammatico con succhi gastrici, ph estremamente basso, condizioni
che un virus deve essere proprio evoluto per superare queste barriere. Quando il virus arriva nell'intestino
trova i succhi pancreatici e sali biliari che attaccano la particella modificandone la propria organizzazione e
impedendone l'espressione e il conseguente ciclo replicativo. Queste mucose sono formate da un mono
strato di cellule, al contrario la mucosa vaginale che è pluri stratificata le cellule superficiali sono cellule
squamose altamente differenziate che hanno cessato di dividersi, ancora una volta una cellula quiescente non
è un ambiente ottimale per il virus che ha bisogno di cellule metabolicamente attive ed inoltre questa
mucosa per essere porta di ingresso per un virus deve essere lacerata, ma le difese non si limitano
all'organizzazione della mucosa, ma sapete che la vagina è colonizzata da lattobacilli che determinano un ph
estremamente basso situazione non vantaggiosa per la maggioranza dei virus. Possono essere superate ma il
ruolo di queste barriere fisiche è quello di diminuire il numero di virus che penetrano all'interno del nostro
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Virologia molecolare organismo, penetrare nel nostro organismo vuol dire far scattare immediatamente quella che è la risposta
innata.  
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Virologia molecolare 4. La risposta innata ai virus
 
Questa risposta innata ha a disposizione 4 armi, questi sono i fagociti primi fra tutti i macrofagi, il sistema
del complemento, l'interferon e le cellule natural killer.  
Questi sistemi possono scattare e funzionare da soli o se il numero di virus infettanti è molto elevato agire in
concerto tra di loro attivandosi le une con le altre.  
 
I macrofagi
I macrofagi hanno un ruolo determinante nel far scattare la risposta innata; i macrofagi sono delle cellule
sentinella localizzate subito al di sotto della mucosa, sono cellule spazzine, possono fagocitare un virus e i
detriti che vengono fagocitati entrano formando un fagosoma che si fonde con i lisosomi che sono carichi di
enzimi come proteasi, nucleasi che attaccano il microrganismo distruggendolo, il forte metabolismo a livello
del fagolisosoma provoca prodotti tossici dell'ossigeno e morte dell'organismo. Se pochi virus infettano il
nostro organismo, i macrofagi senza chiedere permesso a nessuno catturano, distruggono e risolvono da soli
velocemente l'infezione.  
 
Cosa succede se il numero dei virus invasori è molto alto?  
I macrofagi sono in grado, grazie a citochine, di richiamare altre cellule fagocitarie come monociti circolanti
che sono i precursori dei macrofagi e i leucociti polimorfonucleati che costituiscono il 70% dei globuli rossi,
richiamati dai macrofagi possono raggiungere il sito di infezione dove i virus hanno superato le barriere
fisiche, e svolgere il loro compito di cellule fagocitarie. Un aspetto molto importante dei macrofagi è che tra
i fagociti svolgeranno il ruolo di mediatori tra la risposta innata e quella adattativa, fungono da cellule
presentanti l'antigene.  
Come fa un macrofago ad accorgersi che c'è qualcosa di strano nel nostro organismo?  
I microrganismi hanno nella loro superficie dei profili molecolari associati ai patogeni che caratterizzano un
gruppo di microrganismi, un esempio tipico è il lipopolisaccaride che ha una struttura e un profilo di
riconoscimento che caratterizzano tutti i gram negativi, lieviti con profilo molecolare associato a un
patogeno rappresentato dal zimogeno, acidi teicoici dei gram positivi, particolari strutture presenti
sull'envelope di un virus, rna a doppia catena dei ribovirus; quindi delle molecole che caratterizzano non un
gruppo di microrganismi dei virus ma sono caratteristiche di un determinato gruppo, proprio utilizzando
questi profili molecolari di riconoscimento per esempio come gli acidi teicoici dei batteri gram positivi,
lipoproteine dei micobatteri, molecole di rna a doppia catena, sono tutti gruppi molecolari che consentono al
fagocita di individuare un particolare gruppo di microbi.  
 
Ma come avviene questo riconoscimento? Se i profili molecolari associati al patogeno sono presenti sul
patogeno vengono riconosciuti dal fagocita mediante un profilo recettoriale di riconoscimento PRR, quindi
da una parte abbiamo una molecola caratteristica sul microbo dall'altra un profilo molecolare di
riconoscimento PRR che invece è presente sulla cellula fagocitica. I PRR sono stati isolati per la prima volta
nel moscerino della frutta e sono stati chiamati recettori Toll Like. In questa diapositiva vediamo un
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Virologia molecolare lipopolisaccaride un profilo molecolare associato ai batteri gram negativi che viene riconosciuto dai recettori
Toll Like 4, ovviamente di recettori Toll Like ne abbiamo tanti sulla superficie dei macrofagi che gli
consentono di constatare i diversi profili molecolari che i microbi possono presentare. Come funzionano le
cose? Da prima abbiamo una proteina ( colorata in verde) che si lega al lipopolisaccaride (triangolino rosso),
una volta avvenuto questo legame il lipopolisaccaride viene posizionato nella struttura recettoriale CD14 che
è sulla superficie del fagocita e quando questo avviene la porzione esterna del recettore Toll Like (nel nostro
esempio è il TLR 4 ) subisce un cambio conformazionale. Quindi legando il lipopolisaccaride ad una
proteina che lo lega e posiziona in CD14 si hanno ripercussioni sulla conformazione di TLR4 e l'alterata
conformazione si ripercuote sulla porzione citoplasmatica del recettore che trasmette questo cambio
conformazionale ad una proteina adattatrice.  
 
Cosa comporta questo cambio conformazionale nella proteina adattatrice?  
Comporta l'innescarsi, a cascata, di una trasduzione, di un passaggio di un segnale dalla superficie cellulare
al nucleo. In questa via che stiamo esaminando è importante il momento in cui gruppi fosfato vengono
trasferiti da una molecola all'altra, quando viene fosforilata questa chinasi IkK. Cosa fa questa fosforilasi
IkK quando riceve un gruppo fosforico?  
Va a fosforilare IkB che è quello che tiene bloccato il fattore di trascrizione NFkB, che quando è legato a
questo inibitore è bloccato nel citoplasma. Quando l'inibitore viene fosforilato, NFkB è attivato, può passare
nel nucleo ed è un fattore di trascrizione e determina la sintesi di messaggeri dai quali deriveranno tutte
quelle proteine che servono alla cellula fagocitaria per essere attivata nei riguardi di un particolare
microrganismo invasore.  
 
Ricapitolando: arriva un microrganismo caratterizzato da un PAMP (profilo molecolare associato al
patogeno), è riconosciuto da un PRR chiamato anche recettore Toll Like presente nel fagocita e il loro
incontro innesca, tramite successivi trasferimenti di gruppi fosfato, l'arrivo di un determinato segnale nel
nucleo che fa si che vengano sintetizzati quei geni che portano alla sintesi di quelle proteine responsabili
dell'attivazione delle cellule fagocitiche.  
 
Sistema del complemento
Un'altra arma importante dell'immunità innata è rappresentata dal complemento. Quella che scatta è la
cosiddetta via alternativa di attivazione del complemento, mentre l'attivazione della via classica fa parte di
quella che è l'immunità adattativa per scattare una via classica di attivazione del complemento è necessario
che ci sia un complesso antigene anticorpo. Ma perchè si formi un complesso antigene anticorpo ci vuole
tempo, ed ecco che viene attivata un altra via, la via alternativa.  
Il complemento è costituito da più di 20 proteine, alcune delle quali hanno attività enzimatica, le ultime che
vengono attivate si depositano sulla superficie del microbo e in alcune situazioni nel caso di un virus si
forma questo complesso di attacco alla membrana e verranno fatti fuori più velocemente i virus.  
 
Che influenza ha il complemento sulla replicazione virale?  
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Virologia molecolare È una via alternativa, per distinguersi dalla via classica che è innescata dalla formazione del complesso
antigene anticorpo. 
La prima importante proteina in circolo del complemento è la proteina C3; spontaneamente questa proteina
è degradata in C3a e in C3b. Il C3b è capace di fissarsi alla superficie di un virus e svolge un ruolo
determinante che è quello di opsonizzare, ovvero fa in modo che i fagociti mangino quel virus in maniera
molto più verace e più pronta. Per ora siamo solo all'inizio, l'immunità adattativa è ferma. Il C3b inoltre
richiama e attiva altri fattori del complemento C5, C6, C7, C8, C9, questi, complessandosi gli uni con gli
altri, formano il complesso di attacco alla membrana. Immaginiamo che questo sia l'envelope la membrana
del virus al quale si attacca C3, arriva C5, C6 e cosi via fino a che nella membrana si forma un foro, il virus
perde la proprio integrità, alla quale si accompagna la perdita della possibilità di attaccarsi alla cellula. Man
mano che C3b si fissa al suo virus innesca un maggior clivaggio di C3 in C3a e in C3b, prima avveniva
spontaneamente, ma una volta che C3b è legato alla superficie di un virus la scissione aumenta
notevolmente. Questo comporta che si formino tante molecole di C3a che non stanno legate alla superficie
del virus ma hanno il compito di richiamare cellule fagocitiche, neutrofili, monociti, dal sangue per arrivare
ad aiutare i macrofagi stanziali. Siamo a livello di risposta innata, la risposta adattativa è ferma, non si può
avere attivazione della via classica però grazie a C3 che spontaneamente si scinde in C3a e C3b, il
complemento riesce ad opsonizzare e richiamare altri fagociti grazie al frammento C3a e, grazie
all'attivazione a cascata degli ultimi componenti del complemento, a ledere la superficie dei virus dotati di
envelope.  
 
Queste due armi, macrofagi e complemento, hanno un limite; si accorgono quando c'è un virus invasore
mettono in evidenza solo il virus extracellulare, né i macrofagi né il complemento sono in grado di andare a
guardare dentro una cellula, dove l'infezione virale è all'interno delle cellule, quindi c'è bisogno di nuove
armi che siano capaci di individuare e distruggere le cellule all'interno dei quali un virus si sta replicando.
Queste due armi sono rappresentate dal Interferon e dalle cellule Natural Killer (NK).  
 
Che cos'è l'interferon? 
È una proteina, ne conosciamo di 2 tipi: all'interferon di tipo 1 appartengono quello alfa e beta, che sono
quelli importanti per l'attività anti-virale, mentre all'interferon di tipo 2 appartiene quello di tipo gamma
che ha un ruolo di immuno-modulante. L'interferon è stato scoperto nel 1957 da Lindenmann, fece un
esperimento infettando colture cellulari in laboratorio. Aveva visto però che una successiva infezione di
queste colture con lo stesso virus o virus diversi, non partiva il secondo ciclo di infezione e la proteina
responsabile di questa interferenza virale è stata successivamente identificata con il nome di interferon. E
quando si è scoperto che il nostro organismo produceva una sostanza con potere anti-virale si è gridato a
grande successo abbiamo a disposizione un farmaco che possiamo utilizzare nella terapia delle infezioni
virali. Questo primo entusiasmo è andato scemando, in un primo momento la proteina è stata clonata,
prodotta in grandi quantità ma il risultato è stato deludente perchè ha un emivita estremamente breve, è una
molecola specie- specifica ossia funziona soltanto nella specie che l'ha prodotto, ma l'aspetto più
svantaggioso è che l'interferon è dotato di effetti tossici estremamente pericolosi. Infatti oggi viene usato
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Virologia molecolare solo per infezioni virali piuttosto gravi come epatite B e C, melanomi o altri tumori.  
 
Qual è il punto di partenza per la produzione di interferon e qual è la finalità di questa proteina?  
Molto schematicamente ci aiuta a capire questa diapositiva, a sinistra abbiamo delle cellule infettate che
producono interferon, è una molecola che non dura molto ha un emivita abbastanza breve. Non appena
queste cellule infette la producono la riversano all'esterno.  
 
Qual è il compito di questa molecola nell'ambiente extracellulare?  
È quello di andare a contatto con cellule vicine, porta un messaggio alla cellula non infetta dicendole: “la
cellula vicino a te è stata infettata tu preparati perchè è molto probabile che tra poco anche tu sarai infettata”.
Induce per cui l'espressione di geni che allertano le cellule sane e le tengono pronte a difendersi da una
prossima infezione virale.  
 
Cosa fa scattare nella cellula infetta la produzione di interferon?  
È sufficiente in alcuni casi il contatto tra la membrana citoplasmatica della cellula ospite e il virus dotato di
envelope perchè vengano attivati i geni responsabili per la sintesi dell'interferon; questo è un caso però poco
frequente. Il fattore principale che induce nella cellula infetta la produzione di interferon è rappresentato da
un RNA bi-catenario. La cellula ospite non ha RNA bi-catenario quindi questo RNA bi-catenario virale è
un PRR, funge da profilo molecolare associato al patogeno che può essere riconosciuto da un PRR cellulare
che innesca una serie di fosforilazioni che in ultima analisi portano nel nucleo dei fattori attivati di
trascrizione che consentono l'espressione dei geni dell'interferon.  
 
Ripeto: la cellula è stata infettata dal virus, il virus produce RNA bi-catenario, ovviamente i virus che
avranno un RNA bi-catenario come genoma, come i reovirus, saranno ottimi produttori di interferon, però lo
saranno anche gli rna virus a singolo filamento dovranno esprimere per forza una rna polimerasi rna
dipendente quindi se hanno un rna + lo dovranno copiare in rna – automaticamente questo comporta la
formazione di RNA bi-catenari.  
Secondo voi DNA virus possono formare RNA bi-catenario? Si! Entrambe le catene fungono da stampo nel
processo di trascrizione.  
RNA bi-catenario è riconosciuto come profilo molecolare associato al patogeno da PRR all'interno di quella
cellula ed ecco che scatta una serie di fosforilazioni che attivano la produzione di interferon che va
nell'ambiente extracellulare trova nella cellula sana dei recettori vi si lega e parte un messaggio che arriva al
nucleo per allertare la cellula a difendersi che sarà attaccata da un virus. La cellula allertata quando sarà
infettata blocca la replicazione del virus imboccando una via apoptotica. Ciò è fondamentale perchè argina
l'infezione.  
 
Vediamo un po' meglio come vanno le cose. Questo è il dna, questo è il sito di inizio riconosciuto dalla rna
polimerasi che porta alla sintesi dei messaggeri dell'interferon, a monte troviamo un enhancer e perchè
possa dare avvio ad un processo di trascrizione deve legare dei fattori di trascrizione che devono essere
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Virologia molecolare attivati. Il punto di partenza in quella cellula si è formato un RNA bi-catenario, viene riconosciuto come
profilo associato al patogeno, segue una serie di fosforilazioni che attivano tutti questi fattori. L'enhancer è
fatto di 4 domini regolatori positivi, per avviare la trascrizione è necessario che al dominio 4 si leghino i
fattori ATF-2 e c-JUN sono nella forma non fosforilata nel citoplasma, parte la catena di trasferimento del
segnale, comporta la loro fosforilazione e così fosforilati riescono ad occupare il quarto dominio.
Fosforilazione anche del fattore di regolazione dell'interferon IRF-3 IRF-7 fosforilati durante la trasmissione
del segnale e possono raggiungere il nucleo il terzo e il primo dominio. NFkB è analogo a quanto abbiamo
visto nel lipopolisaccaride. È presente nel citoplasma ed è inibito dal legame con l'inibitore IkB, quando
l'inibitore viene fosforilato NFkB viene liberato e potrà andare ad occupare il secondo dominio di questo sito
di regolazione. Quindi fattori di trascrizione attivati comportano come esito finale il legame della RNA
polimerasi e l'inizio della trascrizione del gene dell'interferon. Partecipano anche delle proteine HMG1 che
sono delle proteine che completano il funzionamento dell'enhancer.  
 
Siamo arrivati a sintetizzare il messaggero dell'interferon, questo messaggero è ricco di AUG ed ha un
emivita molto breve, questi messaggeri vengono poi tradotti e l'interferon riversato all'esterno. Vi ricordo
l'azione di andare ad allertare le cellule vicine sane che hanno dei recettori particolari per l'interferon, sono
Tirosine Kinasi, una di queste è il recettore Jak1 e l'altra è la tirosina kinasi 2 (Tyk2). Quando l'interferon si
lega a questi recettori sono tra loro ravvicinati, sono dotati di attività kinasica e l'avvicinamento l'uno con
l'altro determina che la porzione citoplasmatica venga fosforilata. Una volta che questi recettori sono
fosforilati richiamano dal citoplasma la proteina Stat1 e Stat2 vengono a loro volta fosforilate e questa
fosforilazione comporta la loro dimerizzazione, migrano nel nucleo della cellula dove saranno responsabile
di stimolare i geni indotti dall'interferon. Sono tantissimi i geni indotti dall'interferon con il fine di
proteggere quella cellula, ne nominiamo tre: proteine MX, la 2'-5' oligo di A sintetasi e la ribonucleasi L, la
proteino chinasi dipendente da rna a doppia catena.
 
Come svolgono la loro funzione queste proteine che derivano dai geni indotti dall'interferon?  
Un primo esempio ci viene offerto dalle proteine MX: la cellula è stata avvisata dall'interferon, c'è stata
attivazione di particolari geni indotti dall'interferon, ecco che quella cellula ha prodotto proteine MX. Queste
proteine proteggono la cellula dall'infezione di alcuni rna virus a polarità negativa come per esempio il virus
del morbillo. Quando questi virus infettano la cellula attivata ecco che la cellula ha sintetizzato proteine MX
che bloccano l'attività dell'rna polimerasi rna dipendente. I virus con rna a polarità negativa hanno un
genoma che non può fungere da messaggero quindi un rna polimerasi rna dipendente deve essere un
costituente della proteina virale, è indispensabile al virus per la sintesi del messaggero. Cosa succede se un
virus influenzale entra in una cellula dove sono stati espressi geni indotti dall'interferon? Produzione di
proteina MX che impedisce alla polimerasi di funzionare e bloccano cosi la replicazione di questi virus. Un
altro meccanismo dell'attività anti-virale dell MX nei riguardi dell'influenza è che il virus influenzale pur
essendo un virus ad rna replica nel nucleo, cosi le proteine MX impediscono l'arrivo del virus dell'influenza
nel nucleo blocco del processo replicativo del virus.  
 
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Virologia molecolare L'altra proteina indotta dall'interferon sotto forma di proteina inattivata è rappresentata dalla 2'-5' oligo di A
sintetasi e una ribonucleasi L entrambi queste proteine vengono prodotte in forma inattiva.  
Cosa succede che questa cellula cosi allertata viene infettata?  
Il virus comincia il proprio ciclo replicativo e ancora una volta ha dato origine ad un RNA bi-catenario che è
in grado di interagire con la 2'-5' oligo di A sintetasi presente nella cellula nella forma inattiva attivandola e
l'attività enzimatica forma dei corti oligonucleotidi nei quali residui di A sono legati con un legame 2'-5',
circa 10 residui di A vengono legati in questo modo, una volta formato va a legarsi con la ribonucleasi L,
altra proteina inattiva indotta dall'interferon, che quando lega il 2'-5' oligo di A risulta attivata e fa fuori tutti
gli rna messaggeri sia cellulari che virali. 
 
Ricapitolando: una sintetasi e una ribonucleasi sono prodotte in seguito all'induzione determinata
dall'interferon, sono prodotte come forme inattive, arriva il virus su questa cellula avremo produzione di
RNA bi-catenario che da prima attiva la sintetasi con la formazione di corti oligomeri di A che prenderanno
rapporto con un altra proteina indotta dall'interferon attivandola facendo si che possa svolgere la sua azione
di ribonucleasi degraderà gli rna messaggeri sia cellulari che virali.  
 
La terza proteina indotta dall'interferon è la proteina PKR è una chinasi K che dipende la sua attivazione da
una molecola di RNA bi-catenario. Nella parte alta della diapositiva vedete un classico complesso di pre-
iniziazzione del processo di sintesi proteica, sapete che la sub-unità piccola 40S si lega col transfert della
metionina, con l'rna messaggero e perchè tutto possa avvenire è necessario il fattore della sintesi proteica
eIF-2 legato al GTP, una volta che questo si è assemblato verrà richiamata la sub-unità 60S per dare avvio
ad un normale processo di sintesi proteica. Una volta che si è formato il complesso di pre-iniziazzione viene
liberato il fattore eIF-2 che è stato defosforilato, il GDP va in circolo per andare a partecipare alla
formazione di altri complessi di pre-iniziazzione, prima di fare questo però il GDP deve essere di nuovo
fosforilato e questa ri-fosforilazione avviene grazie all'intervento del fattore eIF-2b.  
 
Cosa succede se in questa cellula l'interferon ha indotto sottoforma inattiva la produzione della kinasi
PKR?  
La cellula ha espresso i geni che sintetizzano il PKR però inattivo, arriva il virus nella cellula allertata e
ancora una volta si avrà formazione di doppia catena di rna farà si che due molecole di PKR legandosi come
dimero si fosforilino l'una con l'altra e la kinasi PKR verrà attivata, che a sua volta andrà a fosforilare il
fattore eIF-2, eIF-2 verrà sequestrato ad opera della PKR sul fattore eIF-2b quindi blocco della sintesi
proteica. La cellula si accorge che qualcosa non sta andando bene e imbocca la via apoptotica morte della
cellula ma attraverso una strategia che argina l'infezione virale. 
Questa rispetto a macrofagi e complemento è un arma che funziona all'interno della cellula bloccandone il
processo replicativo.  
 
Le cellule natural killer
Cellule infette possono essere anche eliminate dall'intervento delle cellule NK. Assomigliano molto ai
Simone Pisu Sezione Appunti
Virologia molecolare linfociti T che svolgono un ruolo nell'immunità adattativa e per essere attivati hanno bisogno di tempo, al
contrario le NK sono sempre pronte a riconoscere le cellule infettate. Hanno due meccanismi di azione.  
 
Dobbiamo dire prima cosa sia l'MHC: è una proteina del complesso maggiore di istocompatibilità
localizzata nella membrana citoplasmatica di tutte le cellule. È fatta di due catene una ancorata alla
membrana citoplasmatica che riflettono la composizione proteica di quella che è la cellula, del catabolismo
proteico di quella cellula che produce proteine, le quali vengono rallentate e legate alle proteine MHC 1 ed
esposte alla superficie, c'è un disegno che mostra in superficie tutte quelle proteine self prodotte all'interno
di quella cellula. Sanno anche presentare anche le proteine virali, il virus va ad infettare quella cellula, le
proteine di quel virus saranno fatte a pezzettini legate alle MHC 1 e presentate alla superficie di quella
cellula ed è proprio questo che consente alle NK di attaccare in modo selettivo le cellule tumorali
risparmiando quelle sane.  
 
Come vanno le cose?  
La NK ha due recettori a disposizione (uno rappresentato in rosso e l'altro in azzurro) il recettore in rosso è
in grado di saggiare le MHC che sono presenti sulla superficie di una cellula, se riconosce molte MHC su
quella cellula la riconosce come cellula normale la cellula avrà la licenza per proseguire. Nelle cellule virus
infette è diverso; quando il virus infetta la cellula porta all'interno proteine MHC, quindi nella cellula infetta
mancano le proteine MHC cosi che questa cellula sulla sua superficie presenterà delle proteine che sono
legate alla replicazione virale, dette proteine da stress. Quando le NK incontrano queste cellule si rendono
conto grazie al recettore rosso che non ci sono MHC e grazie al recettore blu si lega alla proteina da stress e
questo determina l'attivazione della NK che produrrà perforine che bucano la membrana citoplasmatica della
cellula bersaglio e granzimi che penetrano all'interno di questa cellula e imbocca una via apoptotica.  
 
Per quanto riguarda l'immunità innata prima di passare a quella adattativa, è importante sottolineare una
cosa: l'immunità adattativa può funzionare, facevo l'esempio del raffreddore, nel giro di 3 /4 l'immunità
adattativa ben funzionante ne determina quest'infezione e il sistema immuno adattativo non viene neanche
attivato. Molte altre volte la risposta innata non è sufficiente, il numero di virus cresce e c'è bisogno di aiuto
da parte dell'immunità adattativa per mettere fine a quell'infezione virale.  
 
Che cos'è che dice cellule B e cellule T dovete partecipare alla risoluzione di questa infezione virale?  
Un ruolo determinante è svolto dall'interferon, se si produce molto interferon vuol dire che la replicazione
virale è abbondante e molte cellule infettate producono interferon. Un altro segnale è la presenza di
moltissimi detriti derivanti dalla morte cellulare. Prima le quattro armi del sistema innato possono lavorare
anche da sole, ci sono pochi virus bastano macrofagi e complemento a risolvere tutto, se si incrementa il
numero di virus le quattro armi collaborano per aumentare la forza della risposta.  
 
Cosa fanno le NK?  
Ci sono molti virus, cresce la quantità di interferon prodotto e va ad attivare la NK, le NK vanno a produrre
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Virologia molecolare interferon gamma che va ad attivare ancora di più i macrofagi perchè il numero di virus sta aumentando.
Questo macrofago è anche aiutato dal C3b del complemento, a sua volta il macrofago produce un altra
citochina che attiva le NK. Tutti i componenti della risposta innata cooperano tra di loro. Nonostante questo
alcune volte l'immunità innata non ce la fa e deve chiamare in causa tutto il sistema immuno-competente.  
 
Chi è che richiama in causa il sistema immuno-competente?  
Sono le cellule dendritiche, si spostano dal sito di infezione e liberano nel linfonodo più vicino dove
presentano l'antigene alle cellule T. non si limitano a presentare l'antigene ma danno tante altre informazioni
sul luogo e tipo di infezione che è in atto. Per queste caratteristiche le cellule dendritiche sono divenute le
principali cellule presentanti l'antigene.  
 
Le cellule della risposta adattativa hanno tutte origine da una cellula staminale localizzata nel midollo osseo.
Avrete esaminato questa diapositiva più di una volta, precursori mieloidi che daranno origine a cellule
dendritiche e macrofagi e il precursore linfoide da cui si origineranno le cellule B e T, le cellule B
evolveranno in plasmacellule che sono che sono le cellule responsabili della produzione di anticorpi e
raggiungono la piena maturazione nel midollo osseo, mentre le cellule T la raggiungono a livello del timo
dove si formano i loro recettori di superficie.  
 
La cellula B deve sintetizzare un proprio recettore che è ancorato alla membrana citoplasmatica di questo
recettore b. per sintetizzare questo recettore la cellula B deve sintetizzare una catena pesante e una catena
leggera e combinarle sottoforma di dimero per esporle come recettore alla sua superficie. Di questi recettori
ne conosciamo migliaia di migliaia diversi in grado di riconoscere l'enorme popolazione di antigeni.  
Come si crea questa variabilità?  
Supponiamo che questi siano i geni della catena pesante, la sintesi di questa catena è fatta arrivando un rna
messaggero che è costruito a partire da dei moduli. Abbiamo 4 moduli due dei quali sono i principali siglati
con V, I, J, C. Cosa succede in quella cellula quando vuole sintetizzare una catena pesante?  
Di segmenti genetici V ne ha a disposizione circa 200, ne sceglie uno, di moduli I ne ha a disposizione una
50, ne sceglie un altro in modo che ne abbia a disposizione quattro, scegli uno di questi possibili moduli e li
lega insieme. Si genera già in partenza una variabilità enorme. Quando queste sequenze geniche vengono
impacchettate tra loro, si assiste a inserzioni o delezioni, aumento della variabilità, ha catturato anche un
segmento dal modulo C che forma la porzione costante della catena pesante e il risultato è la sintesi di una
catena pesante. Una scelta modulare consente di avere a disposizione tanti geni, fa una scelta gli assembla e
questo crea un enorme variabilità. La stessa cosa viene fatta per sintetizzare la catena leggera del recettore.
La porzione rossa della catena pesante e della catena leggera si combinano per formare un sito di legame.
Ogni recettore che cosi si forma è in grado di legarsi soltanto ad un antigene.  
Si formano tanti linfociti B superficiali gli uni diversi dagli altri per riconoscere un gran numero di differenti
antigeni. Qui abbiamo tre linfociti B uno riconosce l'antigene triangolino, un altro l'antigene stellina e l'altro
l'antigene puntino, ecco che arriva l'antigene stellina sarà riconosciuto ovviamente soltanto da questo
linfocita B che presenta recettore stellina alla sua superficie, avviene un contatto e questa cellula B comincia
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Virologia molecolare a crescere e replicarsi formando un clone, questo processo va avanti per una settimana fino a che questa
cellula che si è evoluta in plasmacellula comincia a secernere antibiotici che sono identici al recettore
presente sulla cellula manca solo quella porzione che legava il recettore alla membrana citoplasmatica della
cellula B.  
Per poter differenziarsi in plasmacellula e produrre anticorpi questa cellula deve ricevere l'aiuto da parte
delle cellule Th2.  
 
Sapete come è fatta un immunoglobulina?  
IgG è fatta di due catene una pesante e una leggera, le porzioni variabili delle due catene si combinano
insieme per formare un sito di legame per l'antigene, avendo due braccia avrà la possibilità di legare due
antigeni in questa figura rappresentata da due triangolini marroni. Sono le globuline più importanti a
difenderci a livello ematico.  
Un altra classe di anticorpi, che sono quelli prodotti per primi nel corso dell'infezione, è rappresentata da
IgM: sono composti da 5 molecole di immunoglobulina hanno quindi dieci mani a disposizione per legare
l'antigene, sono delle molecole avide ma pur essendo avide non interagiscono in maniera molto marcata con
l'antigene e quindi sono avide ma poco affini. IgM sono gli anticorpi che attivano maggiormente la via
alternativa del complemento. In questo caso si forma un complesso antigene anticorpo, nella porzione
costante dell IgM si lega il primo componente C1 del complemento e parte la reazione a cascata, il risultato
sarà opsonizzazione o distruzione delle cellule nel caso si tratti di un virus dotato di envelope. È anche in
grado di neutralizzare il virus ovvero gli anticorpi specifici si legano all'anti-recettore virale e bloccano il
suo legame al recettore presente sulla cellula.  
La seconda classe è rappresentata dalle IgG, dopo un certo periodo si ha una commutazione di classe dalle
IgM si passa alle IgG o alle IgA a seconda di dove l'anticorpo deve funzionare.  
 
Le IgG sono quelle maggiormente prodotte in seguito all'infezione virale a livello ematico, sono quelle
che offrono la migliore difesa a livello ematico contro le infezioni virali.  
Perchè sono cosi forti?  
Innanzitutto anche loro attivano il complemento, hanno capacità opsonizzante, hanno la capacità di
riconoscere proteine su una cellula infetta, ovvero quando il virus cresce all'interno di una cellula modifica,
inserendo proteine virus specifiche, la membrana citoplasmatica di quella cellula, una IgG si lega a una
proteina virale e fa da ponte tra una cellula infettata e la cellula fagocitica. Molto importante è che le IgG
passano dalla madre al feto trasmettendogli l'immunità passiva che è indispensabile al neonato per
fronteggiare, quando ancora è privo di un sistema immuno competente, le prime infezioni alle quali va
incontro.  
 
Le immunoglobuline principali a livello respiratorio, delle mucose dell'intestino, sono le IgA: è un dimero, e
la formazione di questo dimero consente a queste proteine di resistere ai succhi gastrici e hanno la capacità
di transitare nell'intestino. IgA principale difesa a livello delle mucose.  
Chi attaccano gli anticorpi?  
Simone Pisu Sezione Appunti
Virologia molecolare Virus alla stato extracellulare, riconoscono antigeni extracellulari.  
Un grosso pericolo è rappresentato dalle cellule infettate all'interno delle quali si producono un numero
notevole di virus. Il sistema immuno-competente deve avere a livello della risposta adattativa un'arma
importante per riconoscere le cellule infette, quest'arma è rappresentata dai linfociti T citotossici. Tutte la
cellule T non ancora differenziate sono caratterizzate da un recettore, recettore dei linfociti T; il suo ruolo è
quello di riconoscere un antigene presentato da una proteina MHC.
  
Le proteine MHC sono di 2 classi: 
classe 1: sono presenti in tutte le cellule del nostro organismo  
classe 2: sono soltanto presenti nelle cellule che presentano l'antigene, macrofagi, cellule dendritiche e
linfociti T.  
 
Cosa succede?  
Questa è una cellula normale e questa è una cellula presentante l'antigene. Questa cellula normale è stata
infettata da un virus, il virus sintetizza le proteine estranee che nel citoplasma a livello dei proteosomi
vengono rotte in corti polipeptidi antigenici che nel reticolo endoplasmatico sono legati ad una molecola di
MHC 1 e successivamente l'MHC 1 con l'antigene viene esposto alla superficie della cellula e l'antigene cosi
presentato viene riconosciuto dalla cellule T citotossiche. Le cellule T citotossiche con il loro recettore TCR
si legano a quell'antigene e il legame tra cellula infettata e T citotossico è incrementato dal recettore CD8
presente nelle cellule T citotossiche. La cellula T a questo punto induce l'apoptosi di quella cellula infettata e
lo fa rilasciando rilasciando perforine e granzimi. 
Cosa succede se l'antigene si forma all'interno di una cellula presentante l'antigene?  
Abbiamo l'esempio di una proteina estranea che arriva, viene fagocitata, si forma un fagolisosoma dove
l'antigene viene processato. Nel fagolisosoma arrivano anche MHC 2 che portano legata una catena
invariante che viene poi eliminata e l' MHC 2 può essere caricata dell'antigene. Il tutto ancora una volta
viene presentato alla superficie della cellula e riconosciuto dai TCR presenti nelle cellule Th. Le MHC sono
presenti sulle cellule in grado di presentare l'antigene cellule T, cellule dendritiche, macrofagi. L'MHC 2
sono riconosciute dai linfociti Th che fanno due cose fondamentali perchè sono capaci di differenziarsi in
Th1 e Th2. 
Questa è una cellula presentante l'antigene, un macrofago, ha presentato l'antigene alla cellula Th1 che
risponde rilasciando citochine che attivano il macrofago rendendolo capace di una molto maggiore
distruzione. Prima di questa attivazione, legata al contatto con la Th1, alcuni microrganismi se ingeriti dal
macrofago resistono, non vengono distrutti, ma soltanto dopo queste citochine rilasciate dai Th1 attivano
questo macrofago che ne aumenta in maniera notevole la funzione fagocitaria portando a distruggere il
microrganismo. Quindi molto importanti per innescare una risposta infiammatoria.  
La cellula B ha incontrato l'antigene specifico, lo fagocita ma non diventa subito una plasmacellula, ha
bisogno della cellula Th2 che rilascia importanti interleuchine 4,5 così che quella cellula potrà evolversi in
plasmacellula che produce anticorpi responsabile della memoria immunitaria.  
Il nostro sistema immuno-competente, grazie alle cellule dendritiche che sono le cellule che trasmettono le
Simone Pisu Sezione Appunti
Virologia molecolare informazioni sul tipo e luogo di infezione in atto, arrivano ai linfonodi e comunicano alle cellule Th quale
fattore far scendere in campo, mettono in atto la miglior risposta immunitaria.  
 
Simone Pisu Sezione Appunti
Virologia molecolare 5. Il virus dell'influenza
 
È il primo dei virus trasmessi per via respiratoria che considereremo e partiamo proprio dall'analisi di
questa via di ingresso di questi virus è una via di ingresso che se ci ragionate un momento è molto facile
capire che se diciamo con adeguate misure è possibile impedire la trasmissione dei virus trasmessi con gli
insetti utilizzando degli insetticidi, se la monogamia può essere un valido aiuto per ostacolare la
trasmissione dei virus trasmessi per via sessuale o una accurata igiene degli alimenti può impedire l'ingresso
di un virus di acqua è difficile invece arrestare la circolazione di un virus respiratorio.  
 
In una sala di un cinema affollato, sopra un pullman se qualcuno tossisce è estremamente difficile l'unica
arma a nostra disposizione sarebbe quella di arrestare il respiro.  
C'è una certa difesa l'abbiamo nominata la scorsa volta parlando delle vie respiratorie quindi il muco che
ricopre le mucose in questo distretto anatomico, ma molto spesso, come nel caso dell'influenza, la particella
emessa con la tosse veicola i virus, contiene milioni e milioni di particelle virali, ecco che alcune sì possono
essere bloccate dal muco che impedisce l'arrivo della particella virale al recettore presente nella cellula
ospite, un piccolo numero sufficiente però a far partire l'infezione riesce a superare questa barriera naturale
di difesa per raggiungere la cellula ospite.
  
Perché la scelta di questi tre virus respiratori?  
Perché diciamo che sono degli ottimi esempi per vedere come tre virus, pur tutti e tre trasmessi per via
respiratoria, risolvono con delle profonde diversità i problemi che un virus deve risolvere:  
1. essere fondamentalmente in grado di riprodursi,  
2. essere in grado di trasmettersi,  
3. essere in grado di superare quelle che sono le difese dell'ospite.  
 
Com'è fatta una particella di virus influenzale
Questa prima diapositiva molto schematicamente ci fa vedere come è fatta una particella di virus
influenzale: una particella dotata di envelope questo cerchio grigio che vedete in questa figura, alla sua
superficie sono presenti due glicoproteine queste sono l'emoagglutinina e la neuroaminidasi, all'interno
dell'envelope queste sferette grigie rappresentano la proteina di matrice e all'interno sono contenuti 8
neurocapsidi; una caratteristica di questo virus a RNA è quello di avere un genoma frammentato in 8 pezzi;
si tratta di un genoma a polarità negativa che una volta che è penetrato nel citoplasma della cellula ospite
quindi non può prendere un contatto diretto con i ribosomi, deve necessariamente portarsi dietro una RNA
polimerasi RNA dipendente che consentirà al genoma di essere copiato quindi convertito da polarità
negativa a polarità positiva quindi si forma un messaggero e il virus potrà avviare così la propria sintesi
proteica.  
Quindi quando una cellula viene infettata dal virus influenzale qual è la prima sintesi macromolecolare
virus specifica che si manifesta?
Simone Pisu Sezione Appunti
Virologia molecolare Sarà un processo di trascrizione che utilizza una RNA polimerasi RNA dipendente che come dice il nome
utilizza come stampo una molecola di RNA in questo caso l'RNA genomico. Se noi andiamo a vedere più
nei dettagli come è fatta una particella del virus influenzale vediamo che alla sua superficie sono presenti
ben 600 spicole di queste 500 sono rappresentate dall'emoagglutinina che costituisce l'antirecettore ossia la
struttura responsabile del legame del virus alla cellula ospite, le cellule ospiti sono rappresentate dalle
cellule dell'epitelio respiratorio e il recettore presente nella cellula ospite è rappresentato da una molecola di
acido sialico. 500 spicole di emoagglutinina tra poco le vedremo nei dettagli la struttura e la modalità del
funzionamento ed in numero inferiore, sono circa un centinaio le molecole di neuroaminidasi,
neuroaminidasi è la seconda glicoproteina che troviamo inserita nell'envelope del virus dell'influenza.  
Questa neuroaminidasi vedremo svolgere, se l'emoagglutinina comincia all'inizio di un ciclo di
replicazione, la neuroaminidasi svolge invece la sua funzione all'estremo opposto quando il virus sta
gemmando dalla cellula nella quale si è formato. Subito al di sotto sempre a livello dell'envelope è presente
una piccola proteina è la proteina M2 che forma un canale ionico, questo canale ionico svolge un ruolo
determinante quando il virus dell'influenza una volta entrato nella cellula in un processo di endocitosi per
completare il proprio uncoating. Quindi abbiamo detto emoagglutinina, neuroaminidasi e proteina M2 che
forma un piccolo canale ionico importante nel momento dell'uncoating. Subito all'interno del peplos è
presente la proteina M1 che è la proteina di matrice più internamente come vi stavo dicendo 8
nucleocapsidi; guardate un attimo questa figura ciascuno di questi 8 nucleocapsidi è legato ad una RNA
polimerasi RNA dipendente indispensabile perché questi segmenti genomici possano esprimersi. Ciascun
genoma è ricoperto da una proteina nucleo capsidica che avvolge gli 8 segmenti di RNA con una simmetria
elicoidale, una cosa importante che non vi ho detto è che la RNA polimerasi ogni segmento di genoma ne
porta legata 1 copia e risulta formata da tre proteine, queste sono le proteine PA, PB1, PB2 . Inoltre, in
poche copie all'interno della particella virale, è presente la proteina NS2 che vedremo essere importante nel
ciclo replicativo virale, quando i nucleocapsidi neoformati devono lasciare il nucleo, è importante tener
presente questo: la maggior parte dei virus a RNA ha la capacità di replicare nel citoplasma, il virus
dell'influenza fa eccezione, è un virus che nonostante contenga un genoma ad RNA ha scelto di replicare nel
nucleo, giustificheremo questa scelta fra poco, vi anticipo che questo dipende perché fondamentalmente ha
bisogno di ricorrere a un processo di splicing, ovviamente tutto quello che serve per il processo di splicing
nel citoplasma non lo troviamo e quindi questo è un primo motivo per cui il virus deve necessariamente
raggiungere il nucleo per potersi replicare, altro motivo è che l'RNA polimerasi RNA dipendente presente
nella particella virale non è pronta a trascrivere il genoma per formare i messaggeri ha bisogno di un
innesco, per trovare questo innesco deve recarsi nel nucleo, quindi caccia dell'innesco e visto che ha
necessita di ricorrere allo splicing per ottenere, per completare il proprio corredo proteico, di conseguenza è
un virus che replica nel nucleo.  
 
Se io vi chiedessi una domanda forse un po' difficilina: perché questo virus ha scelto di avere un genoma
costituito da 8 pezzi???  
Secondo voi se tutta l'informazione contenuta in questi 8 pezzi fosse legata in un unico pezzo riuscirebbe il
virus a esprimersi in una cellula eucariotica???  
Simone Pisu Sezione Appunti
Virologia molecolare Mi sembra di avervelo anche già detto, unica informazione trascrive, perché ha l'enzima suo, questa lunga
informazione di RNA a polarità negativa; lui ha l'enzima se la trascrive e forma un RNA messaggero,
potrebbe questo RNA messaggero andare tranquillamente nei ribosomi e sintetizzare la proteina???  
La risposta è proprio qua il ribosoma non riconosce un messaggero policistronico forse riuscirebbe a iniziare
a tradurre questa proteina ne vedremo uno la prossima settimana, il rinovirus utilizza proprio questa
strategia, in questo caso cosa si è pensato? taglio a pezzi e ognuno di questi 8 segmenti darà origine ad una
proteina, questi segmenti l'importante è la quantità, che contenuto di informazione genetica hanno?
Andiamo grosso modo da 940 a 2400 ribonucleotidi ognuno di questi segmenti è in grado di sintetizzare per
lo meno una proteina, quindi abbiamo 8 proteine garantite. In realtà i segmenti 7 ed 8 proprio perché
sottostanno a splicing danno origine a due differenti messaggeri, quindi in totale abbiamo 10 proteine.  
In una recente scoperta, che è importante perché aiuta a capire qual è il meccanismo di patogenicità del
virus dell'influenza che è il segmento che codifica per la subunità PB1 della RNA polimerasi quando è letto
secondo un diverso modulo da origine in alcuni sierotipi ad un'altra proteina, quindi alcune specie saranno in
grado di sintetizzare 11 differenti proteine. Ricapitolando 8 segmenti ognuno da 1 proteina siamo già a 8
proteine, i segmenti 7 e 8 per splicing ne danno 2, quindi siamo a 10 proteine , il segmento PB1 può essere
letto con due diversi moduli di lettura che danno origine a due differenti proteine di conseguenza il totale del
numero delle proteine sintetizzate in alcuni sierotipi di influenza arriva a 11. Facciamo adesso una carrellata,
abbiamo visto dove sono localizzati i vari componenti di questa particella virale, questa diapositiva riassume
quanto vi ho detto sino adesso 8 filamenti di RNA a polarità negativa di lunghezza da 890 a 2441 nucleotidi
vediamo che i segmenti 1, 3, 4, 5, 6 una volta che vengono trascritti e tradotti danno origine ad un'unica
proteina, il segmento 2 che è il segmento PB1 da origine a due differenti proteine e il segmento 7 ed 8 danno
origine in seguito a splicing a due proteine. Esaminando questo splicing ci consente di capire quanto i virus
sono intelligenti.  
Dal segmento 7 dopo splicing si formano la proteina M1 che è la proteina di matrice e la proteina M2 che
forma quei canali ionici che abbiamo visto essere rilocalizzati nell'envelope.  
Gli serve ovviamente molta più proteina di matrice che deve localizzarsi al di sotto dell'envelope, mentre di
proteine M2 gli servono molte meno copie, cosa ha pensato il virus??  
Fa una scelta di quantità, di M1 me ne serve molto di più che non di proteina M2 che serve per fare pochi
canali ionici da piazzare nel mio envelope; com'è che organizza questo?? C'è una ratio dello splicing, ossia
ogni 10 molecole di RNA del segmento 7, 9 non subiscono splicing e tradotte danno origine alla proteina di
matrice, mentre una sola che subisce splicing darà origine anche alla proteina M2. La stessa cosa riguarda lo
splicing del segmento 8, NS1 è una proteina veramente molto importante che svolge soprattutto la funzione
di difendere la particella virale da quello che è l'attacco del sistema immunocompetente. La proteina NS2
svolge invece il ruolo, quando il virus si è replicato nel nucleo, i nucleocapsidi devono tornare nel
citoplasma e questo è il ruolo svolto dalla NS2 gli serve una maggior quantità di NS2 rispetto a NS1 ed ecco
che anche in questo caso il rapporto tra gli RNA messaggeri che non subiscono splicing e quelli che invece
lo subiscono anche in questo caso è un rapporto di 9 a 1. Con questa semplice accortezza il virus riesce a
fare una scelta quantitativa sintetizzando ciò che gli è più utile. In questa diapositiva in maniera
estremamente schematica poi torneremo nei dettagli passo dopo passo vediamo come si realizza il ciclo
Simone Pisu Sezione Appunti
Virologia molecolare replicativo del virus influenzale.  
 
Come replica il virus dell'influenza
Il punto di partenza è l'attacco dell'emoagglutinina all'acido sialico che è presente nelle cellule dell'epitelio
respiratorio, una volta che è avvenuto l'attacco il virus entra nella cellula la membrana citoplasmatica della
cellula ospite si introflette per poi staccarsi all'interno della cellula e si forma un endosoma. Fondamentale
perchè il processo possa andare avanti è che il Ph all'interno di questo endosoma scenda, questo attiva il
potere fusogeno dell'emoagglutinina e i nucleocapsidi contenuti nella particella virale possono liberarsi nel
citoplasma.  
 
Vi ho già detto che ha bisogno di procurarsi un innesco per la propria RNA polimerasi come pure abbiamo
appena finito di dire che alcuni suoi messaggeri devono sottostare ad un processo di splicing ecco che per
forza deve andare nel nucleo, che cosa avviene nel nucleo?? Lo vediamo meglio in questa diapositiva:
attacco, endocitosi, abbassamento del pH va nel nucleo l'RNA a polarità negativa grazie all'RNA polimerasi
RNA dipendente che è entrata nel nucleo insieme ai nucleocapsidi viene copiato in molecole a polarità
positiva; alcune di queste molecole a polarità positiva sono RNA messaggeri altri saranno da stampo per la
formazione di genomi negativi per la progenie virale. Una volta che i messaggeri sono stati tradotti e il virus
ha sintetizzato tutte le proteine necessarie al suo ciclo replicativo ecco che le glicoproteine emoagglutinina,
neuroaminidasi e la proteina M2 vengono piazzate nella membrana citoplasmatica della cellula ospite, il
virus riesce in questo punto ad uscire dalla cellula per gemmazione rivestendosi di queste glicoproteine e si
libera così nell'ambiente extracellulare, questa è solo una panoramica adesso esamineremo più nei dettagli
passo dopo passo come il virus realizza questo processo replicativo.  
 
Segue una serie di diapositive con cui presentiamo tutti i componenti che partecipano al ciclo replicativo del
virus dell'influenza, la glicoproteina di superficie maggiormente rappresentata dal virus dell'influenza
abbiamo già visto essere l'emoagglutinina, sono in questo disegno questi coni gialli e svolge il ruolo
fondamentale di essere l'antirecettore, è la porzione della particella virale che si lega all'acido sialico
presente nelle cellule dell'epitelio respiratorio ma non ha soltanto questa funzione è anche la glicoproteina
che è dotata di potere fusogeno e consentirà di realizzarsi il potere dell'uncoating del virus dell'influenza.
Come vedremo svolge un ruolo determinante come antigene ed è anche molto importante per capire
l'andamento epidemiologico del virus dell'influenza e si può manifestare sia sotto forma di epidemie sia
sotto forma di pandemia. La seconda glicoproteina presente è la neuroaminidasi cinque volte meno presente
nell'emoagglutinina la funzione fondamentale della neuroaminidasi, sono questi bastoncini verdi con una
estremità allargata rossa, è quella di favorire al virus, una volta che sta avvenendo la gemmazione del virus
dalla cellula ospite, di consentirne la liberazione in ambiente extracellulare. La funzione della proteina M2 è
quella di formare ve l'ho già detto un canalicolo essenziale per l'uncoating ma vedremo che questa proteina
svolge un ruolo importante anche nel momento di maturazione di nuove particelle virali. Abbiamo poi la
proteina di matrice e questa figura ci serve per osservare una cosa: la proteina di matrice localizzata al di
sotto dell'envelope vedete chiaramente come sono a questa proteina di matrice ancorati gli 8 nucleocapsidi
Simone Pisu Sezione Appunti
Virologia molecolare che legati insieme costituiscono il genoma del virus influenzale. Abbiamo poi la proteina nucleocapsidica
che come vi ho detto riveste con simmetria elicoidale i singoli pezzi del genoma del virus influenzale, un
ruolo importante è che regola il meccanismo di funzionamento dell'RNA polimerasi RNA dipendente, cosa
voglio dire con questo??  
L'RNA polimerasi RNA dipendente un minuto fa vi ho detto necessita di un innesco e questo è il motivo per
cui il virus va nel nucleo, però in un momento successivo deve essere anche capace di funzionare senza
innesco, quindi ha una doppia attività funzionale, necessita di un innesco però in un determinato momento
del ciclo replicativo è in grado di trascrivere anche senza un innesco.  
Chi è che regola questo passaggio??  
È regolato lo vedremo tra poco dalla quantità di proteina nucleocapsidica, altra proteina fondamentale è
proprio questa RNA polimerasi che come abbiamo visto è costituita da tre subunità: la subunità PA, la
subunità PB1 e la PB2. Cosa fa la subunità PA non è stato ancora palesato, il ruolo che svolga non è
conosciuto; il ruolo della PB1 è quello di consentire l'ottenimento di un cap come pure è la porzione della
polimerasi che è dotata di attività polimerasica ossia è quella che scorrendo lungo lo stampo sintetizza nuove
catene di RNA. La terza subunità PB2 è quella che si lega alla porzione dell'RNA messaggero cellulare da
cui il virus ricaverà il proprio cap. Stiamo per finire questa carrellata , ci sono altre due proteine siglate come
NS1 e NS2, cosa vuol dire NS??? vuol dire nucleo strutturali, proteine che troviamo all'interno di una cellula
quando il virus sta replicando ma non entrano a far parte della proteina completa virale infettante che si
libera da una cellula ospite. Recentemente sono molte le nuove conoscenze che riguardano l'NS2 e che in
realtà poche copie sono presenti all'interno di una particella di virus infettante tanto è vero che è stata
nominata con la nuova sigla NEP che vuol dire proteina di esportazione nucleare; infatti la funzione di
questa proteina è quella, una volta che sono stati neosintetizzati nel nucleo i nucleocapsidi, di portarli nel
citoplasma da dove poi potranno gemmare formando nuovi virus. Per quanto riguarda l'NS1, proteina
fondamentale perché contrasta le difese dell'ospite, però è anche importante perché è la proteina che aiuta il
virus a far fuori gli RNA messaggeri cellulari per non avere concorrenti a livello dei ribosomi. Qui abbiamo
una banalissima animazione : il virus entra dopo che si è legato ai recettori di acido sialico, c'è un processo
di endocitosi, in questa particella di endocitosi l'emoagglutinina acquista potere fusogeno permettendo l'
uncoating. In questa animazione vediamo che è un uncoating completo, vedete come il virus si spoglia di
tutte quelle che sono le proteine capsidiche e nel citoplasma si libera un genoma, questo non avviene
ovviamente nel caso dell'influenza, i nucleocapsidi appena liberati dopo che si ha fusione e liberazione nel
citoplasma vanno interi nel nucleo dove entrano attraverso un poro nucleare.  
 
Entriamo adesso nei dettagli, l'emoagglutinina (vi ripeto ancora una volta) è quella glicoproteina di
superficie responsabile dell'attacco e anche di consentire l'uncoating del virus dell'influenza, risulta presente
sotto forma di trimero alla superficie dell'envelope e diciamo ciascuno di questi tre polipeptidi insieme
costituiscono il recettore. Appena sintetizzata l'emoagglutinina consiste di un unico polipeptide, questo
unico polipeptide neosintetizzato viene localizzato nella membrana citoplasmatica cellulare il virus poi se la
porterà dietro nel processo di gemmazione e per poter acquisire il potere fusogeno deve essere clivata in due
parti, chi è che cliva l'emoagglutinina nelle due porzioni HA1 e HA2??? Sono delle proteasi che troviamo
Simone Pisu Sezione Appunti
Virologia molecolare nell'epitelio delle vie respiratorie, cosa succede quando questa proteina viene clivata?? Viene clivata nelle
due porzioni dicevo HA1 che contiene il dominio dell'antirecettore ossia è quella porzione
dell'emoagglutinina che è in grado di riconoscere l'acido sialico. La porzione invece HA2 che è inserita,
prima c'è una porzione idrofobica e con una corta coda viene inserita nel citoplasma stiamo esaminando la
sua estremità C mentre all'estremità N terminale è presente la porzione cosiddetta del peptide fusogeno.
Unico polipeptide viene clivato in due, una prima porzione HA1 in questa porzione è localizzato
l'antirecettore, la porzione HA2 invece troviamo il peptide responsabile invece della fusione. Questo peptide
responsabile della fusione rimane nascosto in una porzione idrofobica dell'emoagglutinina e soltanto
all'interno di un endosoma, dopo essere avvenuto l'attacco, il virus per endocitosi è stato portato all'interno
della cellula, ecco che questo peptide fusogeno può essere esposto, le due porzioni dell'emoagglutinina HA1
e HA2 sono tenute insieme tra loro da un ponte disolfuro.
  
Cosa succede alla fase di uncoating? 
Attacco, formazione della vescicola endocitotica e il virus deve andare avanti perché deve liberare i propri
nucleocapsidi nel citoplasma della cellula infetta, questa è la situazione questa che vedete qua è la
membrana dell'endosoma all'interno della quale è presente il virus dell'influenza e alla superficie della
membrana dell'endosoma è presente una pompa protonica, qual è il compito di questa pompa protonica??
Portare all'interno dell'endosoma degli ioni idrogeno, cosa comporta l'ingresso di idrogenioni?? ovviamente
un abbassamento del pH ed è proprio a seguito di questo abbassamento del pH che si ha esposizione del
peptide fusogeno, che ha subito un cambio conformazionale a seguito dell'abbassamento del pH, è in grado
di fissarsi su una membrana dell'endosoma avvicina la membrana dell'endosoma al peplos virale realizzando
così la loro fusione e a questo punto c'è un momento deve intervenire qualche altra cosa per consentire agli 8
segmenti agli 8 nucleocapsidi di passare nel citoplasma. Siamo arrivati che grazie all'abbassamento del pH
l'emoagglutinina ha cambiato la conformazione e questo ha consentito alle due membrane di fondersi una
con l'altra. Però gli 8 segmenti, gli 8 nucleocapsidi sono legati alla matrice, non è facile distaccarli, ecco che
interviene la proteina M2 che forma quei canalicoli che sono localizzati nell'envelope del virus, c'è una
pompa protonica che fa entrare idrogenioni ecco che questi idrogenioni attraverso il canalicolo formato
dall'M2 riescono a penetrare all'interno della cellula.  
Questo abbassamento all'interno della particella virale diminuisce il legame tra matrice e i nucleocapsidi che
possono finalmente arrivare nel citoplasma per poi dirigersi nel nucleo. Quindi sia l'intervento della
emoagglutinina che l'intervento della proteina M2 è fondamentale per arrivare alla completa liberazione del
virus dal suo envelope.  
 
Abbiamo sottolineato all'inizio di questa lezione come pur essendo un virus a RNA deve raggiungere il
nucleo perché gli serve un cap e perché deve andare incontro a splicing, essendo un RNA ovviamente si
deve portare dietro un RNA polimerasi RNA dipendente che è schematizzata in questa figura: è costituita da
tre subunità PA, PB1, PB2 e la subunità PB1 porta legate tutte e due le estremità 3' e 5' dell'RNA
genomico a polarità negativa. Tutti questi 8 frammenti di nucleocapsidi devono raggiungere il nucleo. Uno
dei motivi ve l'ho già detto un paio di volte è che questa RNA polimerasi RNA dipendente per funzionare ha
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Virologia molecolare bisogno di un innesco.  
Quali sono le polimerasi che sempre hanno bisogno di un innesco? 
Le DNA polimerasi, molte RNA polimerasi RNA dipendenti dei virus riescono a trascrivere anche senza un
innesco, un' eccezione ma non unica è rappresentata dalla polimerasi dell'RNA, che cosa si è pensato?
 Vado nel nucleo dove trovo pre-RNA messaggeri cellulari, taglio un pezzettino di questo RNA messaggero
cellulare e lo utilizzo per l'innesco per la trascrizione virus specifica. Va nel nucleo vedremo tra poco come,
taglia un pezzetto di cap ed ecco che la polimerasi utilizza questo frammento derivato dal messaggero
cellulare come innesco per la sintesi degli RNA messaggeri virali. Osserviamo le cose un po' più da vicino,
abbiamo visto come il virus si spoglia e come vengono liberati gli 8 nucleocapsidi; questi 8 nucleocapsidi
grazie all'importina alfa e all'importina beta riescono a lasciare il citoplasma e attraverso un poro nucleare
arrivare nel nucleo.  
Cosa deve fare ciascun frammento?  
Ovviamente per prima cosa deve essere trascritto nel corrispondente messaggero perché questa è l'unica
possibilità che ha il virus per esprimere la propria informazione genetica; quindi ingresso dei nucleocapsidi e
grazie all'intervento della RNA polimerasi RNA dipendente siamo, al passaggio 2, formazione di RNA
messaggeri che hanno un cap di derivazione cellulare. Una volta che si sono formati questi RNA messaggeri
ovviamente devono andare per poter essere tradotti nel citoplasma dove la cellula metterà a disposizione del
virus i propri ribosomi e tutto il proprio macchinario proteino-sintetico.  
Cosa succede quando l'enzima l'RNA polimerasi RNA dipendente deve sintetizzare i propri messaggeri?
Abbiamo visto che è costituito da tre subunità, di una delle subunità la PA non conosciamo ancora il
funzionamento, in questo schema sono presenti soltanto le altre due subunità che sono la PB2 e la PB1.  
Quale è il ruolo della PB2?
Il ruolo della PB2 è quello di legarsi ad un RNA messaggero cellulare non ancora rimaneggiato e di
associarsi con questo RNA messaggero cellulare PB2 lo fissa, dopo di che interviene la PB1 che cliva l'
RNA messaggero cellulare ad una lunghezza che va da 10 a 13 ribonucleotidi e una volta che c'è questo
frammento derivato da un messaggero cellulare la PB1 lo può utilizzare come innesco e cominciare a
copiare il genoma virale realizzando così la formazione di un RNA messaggero specifico virale. Una cosa
non vi ho detto la subunità PB1 fa tutto questo, ossia copia il genoma negativo in positivo rimanendo legata
all'estremità 5' del genoma, questo diciamo è indicato dalla figura non progressivamente ma facendo vedere
questa subunità della polimerasi con un cerchio colorato più debolmente e con i margini tratteggiati. Si è
conquistato un cap, la PB1 comincia a copiare e fa tutto questo restando ancorata all'estremità 5'.  
Quando il processo di trascrizione va avanti e siamo nelle vicinanze dell'estremità 5' la lettura incontra una
sequenza di poli U è l'RNA polimerasi RNA dipendente si dice che legge incominciando a balbettare, ossia
quando sta leggendo questa sequenza di poli U va avanti e indietro, cosa comporta questo?  
Comporta la sintesi di una catena di poli A che caratterizza tutti quanti gli RNA messaggeri degli eucarioti
che possono essere così trasportati dal nucleo al citoplasma dove possono essere tradotti, però è importante
la modalità di sintesi, la modalità con cui un messaggero si procura una coda di poli A nell'influenza è
diversa da quello che avviene nelle cellule eucariotiche. Nelle cellule eucariotiche abbiamo un enzima che
cliva nel sito dove deve essere aggiunta la coda di poli A che poi viene assemblata da un'altra attività
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Virologia molecolare enzimatica che viene legata a questi RNA messaggeri in via di completamento e poi tutto e pronto per
viaggiare nel citoplasma. Invece no, e non è un caso, vedremo tra poco perché il virus dell'influenza fa parte
del processo di trascrizione, comincia a sintetizzare va avanti e leggendo più volte questa sequenza di poli U
riesce a crearsi una coda di poli A.  
Finchè finalmente la subunità PB1 si stacca e arriviamo alla sintesi di un messaggero virale che avrà un cap
in 5' di origine cellulare e una coda di poli A alla sua estremità 3'. Questi messaggeri vanno nel citoplasma
dove possono essere tradotti, ovviamente ha preso gli RNA messaggeri, li ha capitozzati e capite
immediatamente che ha dato un bel colpo alla famosa competizione con gli RNA messaggeri cellulari ma
non si ferma qui ,una delle funzioni della proteina NS1 è quella di legarsi a due proteine cellulari che sono
la CPSF ed il fattore PAB.  
Qual è il ruolo nella cellula di queste due proteine?
La prima CPSF, in un messaggero cellulare, è il fattore responsabile di tagliare il messaggero nelle
vicinanze del punto in cui deve essere inserita la coda di poli A: c'è un messaggero in via di formazione,
un'attività enzimatica, siamo all'estremità 3', lo taglia e individua così il sito di poliadenilazione; la seconda
attività enzimatica PAB ha il compito di facilitare l'inserzione della coda di poli A perché questo è
importante? Perché la proteina NS1 blocca queste due attività enzimatiche e da un'altra mazzata in testa agli
RNA messaggeri cellulari, da una parte gli ha tagliato la testa da l'altra grazie all'intervento della NS1 blocca
la poliadenilazione degli RNA messaggeri ed ecco che in fase nucleare i messaggeri cellulari vengono
distrutti. Un colpo da una parte ed un colpo dall'altra: prende diciamo più messaggeri virali e dall'altra
abbiamo una degradazione invece dei messaggeri cellulari.  
Abbiamo visto come l'RNA messaggero ha ottenuto un cap e una coda di poli A, può andare in sede
citoplasmatica, ecco che questi RNA messaggeri andranno nel citoplasma dove potranno essere tradotti nelle
proteine virali. Una volta che sono state sintetizzate le tre subunità che compongono la polimerasi e la
nucleoproteina dal citoplasma si rilocalizzano nel nucleo e adesso abbiamo la possibilità che si abbia la
formazione di un anti-genoma cosa vuol dire questo?? Sino ad adesso abbiamo avuto sintesi di RNA
messaggeri, l'enzima aveva necessità di un cap, l'ha rubato alla cellula, man mano che aumenta la quantità di
nucleoproteina che entra nel nucleo la polimerasi acquisisce la capacità di trascrivere in assenza di un
innesco. Questo consente di sintetizzare delle molecole di RNA a polarità positiva che non avranno funzione
di messaggero ma che funzioneranno invece come anti genoma.  
Ve lo ricapitolo perché forse non sono stata chiara: all'inizio è arrivato nel citoplasma un nucleocapside che
portava con se un RNA polimerasi RNA dipendente che è riuscita a sottrarre un cap ai messaggeri cellulari e
in questa configurazione l'enzima cosa sa fare? Sa sintetizzare gli RNA messaggeri, questi RNA messaggeri
vanno nel citoplasma, vengono tradotti nelle proteine ed ecco che la proteina nucleocapsidica e le tre
subunità dell' RNA polimerasi ritornano nel nucleo; man mano che la quantità di nucleoproteina aumenta
nel nucleo ecco che si ha un cambiamento nel funzionamento dell'RNA polimerasi RNA dipendente,
acquista la capacità di trascrivere il genoma a polarità negativa anche in assenza di un cap e questo è
importante perchè riesce a copiare per intero il genoma del virus influenzale portando alla formazione di un
anti genoma positivo.
Che ruolo avrà questo anti genoma a polarità positiva?  
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Virologia molecolare Farà da stampo per la formazione di nuovi genomi a polarità negativa. Esattamente come questo avvenga
non lo sappiamo però è stato dimostrato che con bassi livelli di nucleoproteina abbiamo sintesi di mRNA,
mentre con elevati livelli di nucleoproteina abbiamo replicazione del genoma. Funge il genoma del virus da
stampo per la formazione di anti-genomi a polarità positiva che a loro volta saranno stampo per la
formazione di nuovi genomi.  
Siamo al punto che nuovi genomi e nuovi nucleocapsidi del virus influenzale si stanno accumulando nel
nucleo; nel frattempo a livello della membrana citoplasmatica della cellula si sono inserite glicoproteine
emoagglutinina e neuroaminidasi il problema da risolvere a questo punto è come far tornare indietro i nuovi
nucleocapsidi, il loro trasferimento dal nucleo al citoplasma è possibile grazie all'intervento della proteina di
matrice e della proteina NS2. Anche queste due proteine, appena sintetizzate nel citoplasma, tornano nel
nucleo da prima prende contatto con il nucleocapside la proteina M2 e a questa proteina M2 si lega la
proteina NS2 che è appunto responsabile di condurre questi segmenti dal nucleo nel citoplasma.  
A questo punto deve viaggiare nel citoplasma fino a trovare quelle porzioni di membrana citoplasmatica,
sono porzioni particolarmente ricche in colesterolo, dove sono state inserite l'emoagglutinina e la
neuroaminidasi. Ed è appunto in questa diapositiva che è diciamo rappresentata lo stadio finale del processo
di maturazione del virus, grazie all'intervento della proteina di matrice e dell'NS2 i segmenti fatti dal
genoma e rivestiti da proteine quindi i nucleocapsidi con l'intervento della proteina di matrice e dell'NS2
hanno raggiunto il citoplasma, la membrana citoplasmatica nel frattempo si sono inserite l'emoagglutinina e
la neuroaminidasi, la matrice si dispone all'interno di queste porzioni di membrana citoplasmatica, i
nucleocapsidi si fissano alla proteina di matrice, il virus può fuoriuscire attraverso un processo di
gemmazione, ma mentre sta gemmando c'è un rischio: il rischio che questa è la cellula, qui vedete un
processo di morfogenesi in via di completamento, e questo è invece un processo di morfogenesi quasi
completamente realizzato.  
C'è il rischio che le emoagglutinine, alla superficie di questo virus neoformato, siano come dire bloccate
dall'acido sialico della cellula infettata che tende a trattenerle, e questo è impedito dall'intervento della
seconda glicoproteina di superficie rappresentata dalla neuroaminidasi.  
Cosa fa la neuroaminidasi?
La neuroaminidasi scinde il legame tra emoagglutinina e acido sialico ed ecco che il virus completamente
libero in ambiente extracellulare è pronto per andare ad infettare un'altra cellula. La neuroaminidasi libera
l'emoagglutinina, l'emoagglutinina riconosce l'acido sialico, l'acido sialico presente su questa cellula tende a
ricatturare l'emoagglutinina impedendo al virus di liberarsi, quindi il ruolo è di consentire il completo
rilascio del virus rompendo il legame tra emoagglutinina e acido sialico. La sua funzione è anche importante
nel muco, quando il virus dell'influenza arriva nell'epitelio respiratorio nel muco c'è abbondanza di acido
sialico, se l'emoagglutinina si fissa su questo acido sialico perde la possibilità di raggiungere la cellula
ospite, di conseguenza è necessario l'intervento della neuroaminidasi che rompe questo legame, dicendo
puoi continuare la tua strada nelle vie respiratorie fino finalmente a trovare un emoagglutinina localizzata su
una cellula che può diventare la cellula ospite.  
 
Perché è stato chiamato virus dell'influenza?
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Virologia molecolare