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La ricombinazione conservativa sito-specifica

Nella ricombinazione conservativa sito-specifica (CSSR), il segmento di DNA che viene spostato porta sul sito dello scambio genico degli specifici elementi, costituiti da corte sequenze, detti siti di ricombinazione. Un tipico esempio di questo tipo di ricombinazione è dato dall'integrazione del genoma del fago λ nel cromosoma batterico. Durante l'integrazione di questo fago, la ricombinazione avviene sempre esattamente sulla stessa sequenza nucleotidica all'interno di due siti di ricombinazione, uno sul DNA fagico e l'altro su quello batterico. I siti di ricombinazione portano due tipi di elementi di sequenza: quelli specificamente legati dalla ricombinasi e le sequenze dove avviene il taglio del DNA e la riunione. Comunque, la CSSR può dare origine a tre diversi tipi di riarrangiamento del DNA: (1) l'inserzione di un segmento di DNA in un sito specifico (come avviene durante l'integrazione del fago λ); (2) la delezione di un tratto di DNA; (3) l'inversione di un pezzo di doppia elica. Se la ricombinasi porta ad un'inserzione, a una delezione o a una inversione dipende dall'organizzazione dei siti di riconoscimento per la ricombinazione sulla molecola o le molecole di DNA che partecipano all'evento, per questo è utile analizzarli in dettaglio.  Ciascun sito di ricombinazione è costituito da un paio di sequenze di riconoscimento della ricombinasi, organizzate in modo simmetrico. Queste sequenze di riconoscimento fiancheggiano una corta sequenza centrale asimmetrica, nota come regione di scambio, dove avviene il taglio e la riunione del DNA. Dal momento che la regione del crossing over è asimmetrica, un sito di ricombinazione ha sempre una polarità definita. L'orientamento dei due siti presenti su una sola molecola di DNA può essere del tipo ripetizione invertita o ripetizione diretta. La ricombinazione tra un paio di siti invertiti inverte il pezzo di DNA tra di essi compreso; al contrario, la ricombinazione che avviene con il medesimo meccanismo tra due siti organizzati in modo diretto (non invertiti) provoca la delezione del tratto di DNA incluso. Infine, si ha un inserzione quando due siti di ricombinazione presenti su due molecole diverse sono uniti per lo scambio.
Ci sono due famiglie di ricombinasi per le reazioni conservative sito-specifiche: le ricombinasi in serina e le ricombinasi in tirosina. Per entrambe le famiglie, il meccanismo fondamentale consiste nella formazione, durante il taglio del DNA, di un intermedio covalente proteina-DNA. Per la ricombinasi in serina è la catena laterale di un residuo di serina situata nel sito attivo della proteina attacca uno specifico legame fosfodiesterico presente sul sito di ricombinazione, mentre per la ricombinasi in tirosina è la catena laterale di una tirosina, presente nel sito attivo, che attacca e poi unisce covalentemente il DNA. Comunque, in entrambi i casi, l'intermedio covalente proteina-DNA conserva l'energia del legame fosfodiesterico idrolizzato per far sì che i filamenti di DNA possono essere riuniti, invertendo il processo di taglio. In questa reazione inversa, un gruppo OH del DNA interrotto attacca il legame covalente che unisce la proteina al DNA. Questo processo richiude covalentemente la rottura della doppia elica e libera una molecola di ricombinasi.

La CSSR avviene sempre tra due siti di ricombinazione. Come abbiamo visto precedentemente, questi siti possono essere sulla stessa molecola di DNA (per l'inversione e la delezione), o su due molecole diverse (per l'integrazione). Ogni sito di ricombinazione è costituito da una doppia elica di DNA, per questo per dare origine al DNA riarrangiato, si deve avere la rottura di quattro singoli filamenti di DNA (due per ogni duplex) e, quindi, la riunione con un diverso filamento partner. Una molecola di ricombinasi attua tutte queste reazioni di taglio formando un tetramero (quattro subunità, una per ogni filamento. La differenza tra le due famiglie di ricombinasi sta nel fatto che mentre quelle in serina tagliano ed uniscono tutti e quattro i filamenti di DNA, quelle in tirosina, dapprima tagliano ed uniscono due filamenti di DNA e, solo dopo, tagliano ed uniscono gli altri due filamenti. Il meccanismo della ricombinazione sito-specifica è meglio compreso per le ricombinasi in tirosina. Un ottimo esempio è fornito dalla struttura della ricombinasi Cre. Questa è un enzima codificato dal fago P1, che serve a linearizzare il genoma virale durante l'infezione. I siti di ricombinazione del DNA, su cui Cre agisce, sono detti siti lox. Le strutture Cre-lox mostrano che la ricombinazione richiede quattro subunità di Cre, ciascuna delle quali è legata ad un sito di legame sulla molecole di DNA substrato. Generalmente la conformazione del DNA è una struttura planare cruciforme con ogni “braccio” di questa giunzione legato da una subunità Cre. Cre esiste in due diverse conformazioni, 1 e 2, con due subunità ciascuna. Solo una di queste conformazioni può tagliare e riunire il DNA. Quindi, solo una coppia di subunità ala volta è in una conformazione attiva. Con il procedere della reazione cambia la coppia di subunità nella conformazione attiva. Questo scambio è critico per il controllo della progressione della ricombinazione e garantisce che il meccanismo di scambio avvenga in modo sequenziale, “un filamento alla volta”.
Tratto da BIOLOGIA MOLECOLARE di Domenico Azarnia Tehran
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